综述：禽流感在家禽中的韧性遗传策略：从宿主-病原体相互作用研究到精准育种

《Functional & Integrative Genomics》：Genetic strategies for avian influenza resilience in poultry: from host-pathogen interaction studies to precision breeding

本综述系统探讨了利用遗传策略增强家禽对禽流感病毒（AIV）韧性的前沿进展。文章聚焦于宿主细胞内限制因子（如Mx、TRIM蛋白、BTN3A3、RIG-I）和病毒靶向策略（如RNAi、CRISPR-Cas13），并强调了全基因组筛选（如CRISPR/Cas9筛选）在发现高置信度宿主靶点中的关键作用。作者指出，结合精准育种（如转基因和基因编辑技术）开发具有AIV韧性的家禽品系，是未来可持续疾病管理的重要方向，有望与疫苗接种和生物安全措施协同，转变禽流感防控范式。

　　

禽流感病毒

禽流感病毒（AIV）是对全球家禽生产和公共卫生的持续威胁。A型流感病毒（IAV）是正粘病毒科的有包膜RNA病毒，其基因组包含8个单链负义RNA节段。根据表面抗原血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的特性，IAV可进一步分为不同亚型，其中能感染禽类宿主的被称为禽流感病毒，主要属于H5、H7和H9亚型。野生水禽和岸鸟是AIV的天然储存宿主。根据对鸡的致病性，AIV可分为低致病性禽流感（LPAI）和高致病性禽流感（HPAI）。HA前体（HA0）被细胞蛋白酶切割是决定病毒嗜性和疾病严重程度的关键。LPAI病毒的HA0具有单碱性基序，只能被呼吸道和胃肠道中的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶切割，而HPAI病毒的HA0具有多碱性基序，可被广泛分布的弗林蛋白酶等切割，导致全身性感染。

自1996年首次检测到以来，A/Goose/Guangdong/96 (Gs/GD) H5N1 HPAIV已发生广泛的遗传分化。2.3.4.4b分支H5N1病毒的出现导致了一场波及野生鸟类和哺乳动物（包括美国奶牛）的泛动物疫情，对商业家禽生产造成了深远影响，数百万只家禽被扑杀。在现代高密度饲养模式下，流感病毒的传入会对其进化和传播动力学产生巨大影响。尽管疫苗接种被认为是一种潜在的控制策略，但田间毒株的广泛多样性给其有效性带来了重大挑战。因此，当前缓解HPAIV的策略仍严重依赖于严格的生物安全措施和扑杀感染鸡群。

增强禽流感韧性的遗传方法

提高鸡对AIV感染的韧性，结合疫苗接种和加强生物安全，将成为集约化家禽生产中有价值的性状，并有可能改变疾病管理实践。与疫苗诱导的免疫力不同，旨在增强韧性性状的遗传方法提供了更可持续的解决方案，因为这些性状可以在已建立的家禽育种计划中跨代遗传。

精准育种培育抗性或韧性鸡品系是克服传统选择育种局限性的一个有前途的方法。美国食品药品监督管理局（FDA）批准AquaAdvantage三文郎和抗猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）猪供人消费，表明了转基因动物监管环境的变化。然而，这种应用在很大程度上取决于识别能够有效阻断病毒复制的高置信度宿主因子或抗病毒转基因。全基因组功能筛选平台能够以无偏见和系统的方式更深入地了解病毒-宿主相互作用，可以加速这些努力。

从宿主-病原体相互作用研究中发现的病毒拮抗因子

IAV的复制周期始于病毒HA分子与宿主细胞膜上的唾液酸残基结合。在病毒复制周期的每个阶段，流感病毒都与宿主免疫系统进行持续的进化军备竞赛。大量的宿主-病原体相互作用研究阐明了流感病毒利用宿主细胞机制的基本机制，同时也识别了细胞固有的病毒限制因子。

Mx蛋白

Mx蛋白是动力蛋白样GTP酶超家族的成员，在真核细胞的多种细胞过程中发挥重要作用，包括在病毒感染的细胞中调节I型（α和β）和III型（λ）干扰素（IFN）的抗病毒机制。鸡Mx蛋白主要定位于细胞质，并且由于缺乏GTP酶活性，对AIV没有抗病毒活性。研究表明，鸡Mx蛋白第631位氨基酸的多态性（S631N）与抗病毒活性无关。相比之下，小鼠Mx1（Mu Mx1）被认为是一种有效的抗病毒蛋白。在鸡DF1细胞中转基因表达Mu Mx1可导致多种AIV亚型的病毒滴度显著降低。

TRIM蛋白

三联基序包含（TRIM）蛋白是一类E3泛素连接酶，调节许多细胞过程，包括IFN诱导的抗病毒过程。TRIM蛋白的抗病毒活性主要通过调节宿主先天免疫或通过泛素-蛋白酶体途径直接靶向病毒效应器来介导。例如，干扰素诱导的TRIMs，如TRIM14、TRIM22、TRIM21、TRIM35等，以泛素连接酶依赖的方式促进流感病毒蛋白（如NP、NS、PB1）的降解。在人类细胞中敲除TRIM35会增加对流感感染的易感性。在转基因小鼠中表达人TRIM14可产生不依赖IFN的抗病毒活性，并表现出病毒复制的有效减少。

BTN3A3

嗜乳脂蛋白（BTN）基因家族编码在病毒感染的细胞中上调的干扰素刺激基因（ISGs）。其中，BTN3A3已成为对抗AIV的有效、谱系特异性的限制因子。在人类和猕猴细胞的ISG过表达筛选中发现，BTN3A3能显著抑制鸭源AIV在人类肺上皮细胞（A549）中的复制。BTN3A3在感染早期发挥作用，损害病毒核糖核蛋白（vRNP）复合物的积累。对BTN3A3介导的限制的敏感性由病毒核蛋白（NP）决定，特别是第313位残基。禽类IAV通常在该位点编码保守的苯丙氨酸（313F），赋予敏感性，而人类适应毒株几乎只携带与耐药相关的酪氨酸（313Y）或缬氨酸（313V）。

RIG-I

RIG-I是主要的细胞质RNA传感器之一，在IAV复制时空感知中发挥重要作用。与水禽不同，鸡天然缺乏功能性的RIG-I和RNF135，这与它们对AIV的易感性增加有关。研究表明，在鸡DF-1细胞中过表达鸭RIG-I可显著减少H5病毒复制。然而，转基因表达鸭RIG-I的鸡在感染低致病性AIV（H9N2）后，病毒复制与野生型对照相比没有显著差异。有趣的是，在未感染的转基因鸡中，单独表达RIG-I显著改变了适应性免疫细胞群。在感染高致病性H7N1 AIV后，表达RIG-I的鸡出现严重疾病，而共表达RNF135则显著减轻了疾病严重程度，表明RNF135对于调节RIG-I活性以实现有效的病毒控制而不引发过度炎症是必需的。

通过高通量筛选鉴定的病毒限制因子

全基因组功能筛选使用RNA干扰（RNAi）和CRISPR/Cas9是系统识别影响免疫反应、病毒复制和疾病易感性的宿主因子的强大工具。

高通量筛选方法学

基于CRISPR的高通量方法利用了Cas蛋白的多功能性。筛选通常使用两种主要方法进行：存活筛选和基于分选的筛选。在存活筛选中，经过验证的细胞库用高感染复数（MOI）的病毒进行感染，然后对存活细胞进行连续几轮的收获和扩增。通过多轮感染，具有增强病毒韧性的细胞被逐步富集。另一方面，基于分选的筛选涉及使用流式细胞术来分离表型不同的细胞。

基于CRISPR筛选鉴定的流感病毒限制因子

在人类肺上皮GeCKO细胞中使用靶向约19,050个基因的全基因组敲除（KO）文库进行了首次全基因组筛选以识别IAV宿主因子。该筛选揭示了与病毒进入和细胞固有免疫调节相关的几个宿主因子，其中与唾液酸生物合成和糖基化相关的基因显著富集。另一项研究使用A549-Cas9细胞感染A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1)毒株进行筛选，确定了病毒进入和调控的三个关键宿主因子：WDR7、CCDC115和TMEM199。此外，该研究还强调了CMTR1是病毒采用的“帽抢夺”机制的关键因子。

在HeLa细胞中进行的全基因组CRISPR激活筛选识别了先前未表征的抗病毒基因JADE3。JADE3将组蛋白乙酰转移酶招募到ORC1复合物，调节染色质以调控转录。它是IFITM3的组成型和诱导型表达所必需的，通过激活NF-κB信号通路发挥作用。另一项在A549细胞中进行的系统性筛选发现，过表达B4GALNT2可以抑制流感病毒感染，对所有测试的AIV毒株（包括H5、H9和H7亚型）均有效。最近，Jin等人（2025）在鸡细胞中进行了首次全基因组CRISPR敲除筛选，发现了促进AIV复制的先前未被识别的宿主因子，包括RNF2、DCP1A和CREB3L3。

尽管许多宿主限制因子已在体外被识别，但相对较少在体内得到验证。例如，Mx1在体外和体内均显示出有效的抗病毒活性。BTN3A3在人类细胞中被识别为有效的限制因子，是在鸡体内进行验证的有力候选。B4GALNT2在鸡成纤维细胞中的转基因表达限制了多种AIV毒株的复制。相比之下，SLC35A1在多种研究中被列为顶级宿主依赖性因子，但由于其在基本细胞过程中的关键作用，使其在鸡中敲除不切实际。

靶向流感基因组：基于RNA的抗病毒平台

直接靶向病毒基因组的抗病毒策略正在成为高度特异性和强大的模式。基于核酸的靶向策略特别适用于流感，因为其基因组相对紧凑，且依赖一组必需基因进行复制。

RNA干扰（RNAi）和CRISPR-Cas13是介导序列特异性RNA降解的两种最有前途的核酸平台。使用RNAi对抗AIV首次通过将siRNA递送到鸡胚胎细胞和鸡胚中得到证实。针对流感病毒NP和PA基因的siRNA导致mRNA水平降低，同时抑制了cRNA和vRNA的合成。类似地，CRISPR-Cas13系统已被用于流感病毒的序列特异性靶向。在稳定表达Cas13a的鸡DF1细胞中，使用靶向PB1、NP和M基因节段的多重crRNA载体可显著降低A/WSN/1933 (H1N1)和A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1)的病毒滴度。

利用人工智能（AI）的从头蛋白质设计的最新突破，促进了具有高特异性和明确功能特性的定制抗病毒蛋白的设计。从头设计的蛋白质可以被基因编码用于细胞内表达，转基因表达的可能性仍有待探索。

鸡的基因工程：从病毒载体到精准编辑

实现靶向基因敲除和转基因体内过表达的基因工程技术革命了动物农业（包括禽类）的功能基因组学。

遗传修饰方法

生成转基因禽类模型的早期努力采用了逆转录病毒载体。随后的研究使用慢病毒载体显示了改进的种系传递率。禽类基因工程的一个重大突破是建立了分离和长期培养禽原始生殖细胞（PGC）的方案。将基因靶向载体转染到培养的PGC中，能够产生携带所需遗传修饰的克隆PGC群体。

可编程核酸酶（如ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9）的出现彻底改变了禽类基因组工程。其中，CRISPR/Cas9已成为鸡基因组编辑中广泛采用的系统。最近，Ballantyne等人（2021）开发了一个可诱导的无菌替代宿主鸡系，旨在加速在单一代内开发基因编辑模型。

鸡的疾病抗性或韧性的遗传修饰

首次证明通过遗传修饰赋予鸡对禽流感抗性的研究是将一个合成的RNA发夹（D5诱饵分子）稳定插入鸡种系。尽管转基因（TG-D5）和非转基因鸡在直接感染H5N1后死亡率相当，但转基因鸡表现出显著降低的病毒传播动态。与病毒感染的TG-D5鸡同居的野生型鸡受到显著保护。

为了评估转基因表达单链可变片段（scFv）是否能提供禽流感韧性，June等人（2017）产生了表达3D8 scFv蛋白的转基因鸡。通过接触途径暴露于H9N2 LPAI时，转基因鸡的病毒排出水平降低，免疫反应最小。

使用转基因鸡对先天免疫效应器（如IFITM和IFIT蛋白）作为控制家禽流感病毒的广谱抗病毒策略进行了研究。第一个研究使用基于RCAS的基因传递策略产生了稳定表达chIFIT5的鸡系。用高致病性H5N1攻击表明，表达chIFIT5的鸡临床疾病发作延迟，病毒排出减少。在类似研究中，Rohaim等人（2021）产生了过表达chIFITM1的转基因鸡系。攻击实验表明，表达chIFITM1的转基因鸡与野生型鸡相比，病毒复制和呼吸道组织损伤减少。

最近，Idoko-Akoh等人（2023）开发了基因组编辑鸡，对ANP32A进行了修饰，ANP32A是流感聚合酶在宿主细胞中有效利用的关键宿主辅助因子。通过CRISPR/Cas9介导的种系基因组编辑引入了N129I和D130N突变。暴露于低剂量LPAI H9N2病毒后，基因编辑鸡表现出病毒排出显著减少，且没有后续传播。然而，当使用更高感染剂量时，一部分鸡表现出低水平的零星口腔排出。对从基因编辑鸡排出的病毒进行测序分析显示，H9N2在病毒聚合酶复合物中获得了适应性突变。

结论

自H5N1高致病性禽流感出现二十年来的泛动物疫情已蔓延至野生鸟类种群，成为重大的公共卫生问题。从家禽健康的角度来看，高致病性禽流感继续在全球范围内摧毁家禽业，迫切需要基于科学的、协作的解决方案，整合创新策略以减轻其影响。这些努力的核心将是开发宿主导向的方法，结合疫苗接种努力和生物安全措施，提高家禽种群的韧性。

在此背景下，新兴技术如全基因组筛选和单细胞RNA测序（scRNA-seq）为发现与疾病抗性相关的新的遗传变异提供了前所未有的机会。随着基因编辑技术的应用不断进展，解决病毒通过适应性突变逃逸的风险、预期编辑对关键生产性状（如产蛋性能、体重和整体适应性）的影响至关重要，以确保商业可行性和动物福利不受影响。此外，必须通过严格的安全评估、透明的沟通以及更广泛的公众和利益相关者参与，主动解决公众对转基因食品链的看法问题。

总之，随着高致病性禽流感威胁的不断升级，整合创新技术进行高置信度靶点发现，以及家禽基因编辑的进展，可以为可持续的疾病管理解决方案提供支持，并有助于减轻高致病性禽流感病毒对家禽业的负担。