靶向EMP1/TLN1/FAK信号轴改善MASLD供肝移植缺血再灌注损伤的新机制

《Molecular Biomedicine》：Epithelial membrane protein 1 drives hepatic stellate cell activation via the TLN1/FAK cascade in MASLD donor liver transplantation

本研究针对代谢功能障碍相关脂肪性肝病(MASLD)供肝移植后易发生严重缺血再灌注损伤(IRI)的临床难题，通过多组学分析和机制验证，首次发现上皮膜蛋白1(EMP1)通过竞争性抑制SMURF1介导的talin1(TLN1)泛素化降解，进而激活黏着斑激酶(FAK)信号通路，驱动肝星状细胞(HSC)活化和炎症反应。该研究揭示了EMP1作为MASLD-IRI的新型生物标志物和治疗靶点的潜力，为改善脂肪肝移植预后提供了新策略。

　　

随着代谢功能障碍相关脂肪性肝病(MASLD)患病率的显著上升，脂肪肝已成为扩大移植供肝池的重要来源。然而，临床证据表明即使轻度脂肪变性的供肝也会导致早期移植肝功能不全，这主要归因于脂肪肝对缺血再灌注损伤(IRI)的高度敏感性。这种病理生理相互作用促使研究者深入探索MASLD-IRI的发病机制，特别是肝星状细胞(HSC)在这一过程中的关键作用。

肝星状细胞是肝脏纤维炎症损伤的核心驱动因素，其在MASLD和IRI等病理条件下被激活，通过自我放大环路加剧肝脏损伤。尽管既往研究提示黏着斑激酶(FAK)作为机械信号和可溶性信号的关键整合因子在HSC重编程中起重要作用，但MASLD供肝移植中HSC激活的具体分子机制尚不清楚。上皮膜蛋白1(EMP1)作为一种具有四个保守跨膜结构域的膜蛋白，在肝损伤和纤维化疾病中表达上调，但其在肝脏病理生理学中的具体贡献仍有待阐明。

发表在《Molecular Biomedicine》的这项研究通过构建大鼠MASLD供肝移植模型，结合多组学分析和机制验证，首次揭示了EMP1/TLN1/FAK信号轴在驱动HSC激活和加重肝脏损伤中的关键作用。研究人员发现MASLD供肝在移植后出现更严重的IRI，表现为肝酶水平升高、氧化应激加剧、炎症因子释放增加，并与HSC的显著激活相关。通过转录组测序，他们将研究焦点锁定在EMP1这一显著上调的基因上。

技术方法上，研究采用高脂饮食构建MASLD大鼠模型，通过原位肝移植建立IRI模型，利用OA/PA(油酸/棕榈酸)+IRI细胞模型模拟MASLD-IRI条件。通过RNA测序、蛋白质组学、免疫共沉淀-质谱联用(Co-IP/MS)等技术筛选关键分子，采用AAV6-shRNA尾静脉注射实现体内EMP1特异性敲低，并收集武汉协和医院18例肝移植患者样本进行临床验证。

MASLD供肝通过HSC激活加重移植肝IRI

研究人员首先建立MASLD供鼠模型(高脂饮食)和IRI模型(肝移植)，通过复合模型(ND/HFD-Sham/LT)评估供肝类型对IRI的影响。结果显示HFD-LT组血清ALT、AST水平显著升高，氧化应激标志物SOD和MDA表明氧化损伤增强。H&E、油红O和TUNEL染色显示HFD-LT组肝组织结构破坏更严重、脂质积累增加和细胞死亡增多。炎症细胞因子IL-1β和TNF-α表达上调，α-SMA等HSC激活标志物显著升高，表明MASLD-IRI诱导了广泛的HSC激活和后续炎症释放，但未立即诱导肝纤维化形成。

EMP1作为MASLD-IRI潜在诊断和治疗靶点

通过转录组测序分析，研究人员发现黏着附著(FA)通路在MASLD-IRI诱导的肝损伤中显著富集。在FA通路差异表达基因中，Emp1、Spp1和Itga3显著上调，其中Emp1变化最为显著。在单因素和多因素ND/HFD-Sham/LT组中，EMP1表达呈梯度升高，蛋白和mRNA水平验证均证实EMP1在MASLD-IRI条件下显著上调。

EMP1定位于肝非实质细胞并调控HSC激活

单细胞测序数据库分析显示EMP1主要表达于肝非实质细胞，包括肝窦内皮细胞(LSEC)、HSC和库普弗细胞(KC)。OA/PA+IRI共刺激实验证实EMP1主要在LSEC和HSC中富集。免疫荧光显示EMP1与α-SMA共定位且在HFD-LT组共同上调。EMP1过表达增强而敲低抑制HSC激活，证实EMP1上调是MASLD-IRI中HSC激活的关键驱动因素。

EMP1通过FAK磷酸化促进HSC激活

RNA测序显示EMP1调制引起显著转录组改变，KEGG富集分析再次提示FA信号通路显著富集。EMP1表达与FA通路关键组分PTK2(FAK)、PIK3C(PI3K)和AKT3呈中度正相关。EMP1上调显著增强FAK和AKT磷酸化，而FAK磷酸化抑制剂defactinib可消除EMP1介导的效应并减轻HSC激活，表明EMP1通过FAK磷酸化调控HSC激活。

EMP1通过TLN1调控FAK磷酸化

Co-IP/MS筛选出21个FA通路中可能与EMP1相互作用的蛋白，其中仅TLN1被预测可直接结合EMP1和FAK。免疫荧光和Co-IP证实TLN1与EMP1和FAK之间存在相互作用，结构模拟显示三者可形成稳定复合物。TLN1过表达增强FAK磷酸化和HSC激活标志物表达，而TLN1敲低显著减弱EMP1介导的FAK磷酸化，证明EMP1以TLN1依赖的方式调控FAK磷酸化。

EMP1竞争SMURF1结合位点抑制TLN1泛素化降解

EMP1扰动影响TLN1蛋白而非mRNA表达，表明EMP1通过翻译后修饰调控TLN1。蛋白质半衰期实验显示EMP1过表达增强TLN1稳定性而敲低缩短其半衰期。通过UbiBrowser 2.0筛选出SMURF1作为TLN1互作E3泛素连接酶，Co-IP证实SMURF1与TLN1结合且敲低SMURF1抑制TLN1泛素化。竞争实验表明EMP1和SMURF1结合TLN1的相同C端结构域，共同竞争ASP1815位点。EMP1 p.R123G点突变体失去与TLN1结合能力，无法阻止TLN1泛素化，证实EMP1通过竞争性阻断SMURF1结合抑制TLN1泛素化。

EMP1敲低通过TLN1/FAK轴减轻HSC激活诱导的肝损伤

通过尾静脉注射AAV6-shRNA建立EMP1敲低动物模型，发现EMP1敲低显著减轻HFD-LT组肝损伤，降低ALT、AST和MDA水平，改善肝组织结构破坏和细胞死亡。EMP1特异性敲低降低α-SMA荧光强度，下调TLN1表达、FAK和AKT磷酸化以及HSC激活和炎症标志物表达。原代HSC实验证实破坏EMP1/TLN1/FAK轴中任一组分均可抑制AKT磷酸化和下游信号，表明该通路在HSC激活中起关键作用。

EMP1在MASLD-IRI中的预后监测价值

对武汉协和医院18例肝移植样本分析显示，MASLD供肝表现出更严重的结构破坏和细胞死亡，EMP1表达显著上调。根据EMP1蛋白表达将8例MASLD供肝样本分为EMP1高表达组和低表达组，发现EMP1高表达组术后第1天ALT水平更高，第7天ALT、AST和DBIL显著升高，且TLN1表达、FAK磷酸化、HSC激活和炎症反应更强，验证了EMP1/TLN1/FAK轴在临床样本中促进HSC激活和炎症因子释放的作用。

研究结论表明，EMP1/TLN1/FAK轴是MASLD-IRI中肝脏损伤的放大机制。EMP1表达可作为移植后并发症的预后生物标志物，而EMP1或其与TLN1相互作用的药理抑制可减轻HSC激活，从而提高移植存活率。这些发现为解决当前MASLD供肝使用中的挑战提供了机制和转化框架。

该研究的创新性在于首次揭示EMP1通过竞争性抑制SMURF1介导的TLN1泛素化降解，进而激活FAK信号通路驱动HSC激活的具体分子机制，为MASLD供肝移植的预后评估和靶向治疗提供了新的生物标志物和干预策略。尽管研究存在未全面探讨Spp1和Itga3等功能、EMP1可能通过TLN1非依赖机制调控FAK等局限性，但无疑为改善脂肪肝移植预后开辟了新的研究方向。