靶向膜嵌入CXCR4的小分子抑制剂计算发现：肾纤维化治疗新策略

《Future Journal of Pharmaceutical Sciences》：Finding small chemical modulators capable of blocking 1 membrane-embedded CXCR4, a critical therapeutic target for renal fibrosis: a computational approach

本研究针对慢性肾脏病中CXCR4介导的肾纤维化这一关键病理过程，通过分子对接和动力学模拟筛选出能够稳定结合膜嵌入CXCR4的小分子抑制剂4993。研究人员采用AlphaFold预测的CXCR4结构(AF-P61073-F1)，在POPC膜环境中进行200 ns分子动力学模拟，结合RMSD、RMSF、PCA、FEL和残基分解分析证实4993与CXCR4的D97、D187、E288等关键残基形成稳定相互作用。该研究为开发靶向CXCR4的抗肾纤维化药物提供了新候选化合物。

　　

慢性肾脏病已成为全球公共卫生领域的重要挑战，其中肾纤维化是导致肾功能进行性丧失的核心病理环节。在这种不可逆的病理过程中，C-X-C趋化因子受体4型(CXCR4)作为G蛋白偶联受体(GPCR)超家族的重要成员，通过介导炎症反应和组织重塑发挥着关键作用。当肾脏受损时，CXCR4表达显著上调，持续激活会加剧纤维化反应，促进β-连环蛋白(β-catenin)信号通路活化，最终导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化。尽管已有研究表明CXCR4抑制剂AMD3100能够减轻纤维化进程，但开发更具选择性和稳定性的小分子抑制剂仍是当前研究的重点难点。

在这项发表于《Future Journal of Pharmaceutical Sciences》的研究中，Kumar和Gupta团队采用计算生物学方法，致力于发现能够有效阻断膜嵌入CXCR4的小分子调节剂。研究人员意识到，传统的实验结构(PDB 3OE8)存在明显局限性——缺少多个功能关键区域，且与T4溶菌酶人工融合，无法真实反映天然状态下的受体构象。因此，他们转向使用AlphaFold预测的完整人类CXCR4结构(AF-P61073-F1)，该模型覆盖全部352个氨基酸残基，且具有高置信度(pLDDT>90%)，为精准的药物设计奠定了结构基础。

研究团队首先从ChemDiv抗炎化合物库中筛选23,839个分子，通过高通量虚拟筛选(HTVS)和精确对接(XP)算法识别潜在抑制剂。随后运用ADMETLab2.0进行药代动力学特性评估，最终选定4990、4993和21889这三个具有最优ADME特性的化合物进行深入分析。这些分子均包含具有抗炎、抗氧化活性的特征骨架，如吡嗪、吡啶和1,3,4-噁二唑等基团，这些结构单元在先前研究中已显示出良好的药理活性。

为了模拟生理条件下的受体-配体相互作用，研究人员通过CHARMM-GUI构建了膜-蛋白系统，将CXCR4嵌入1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)脂质双分子层中。使用GROMACS 2022.2软件包，采用OPLS全原子力场进行200纳秒分子动力学模拟，系统分析包括均方根偏差(RMSD)、均方根涨落(RMSF)、溶剂可及表面积(SASA)、回转半径、氢键形成、主成分分析(PCA)、自由能景观(FEL)以及分子力学泊松-玻尔兹曼表面积(MM/PBSA)等多个关键参数，全面评估复合物的稳定性和结合特性。

蛋白构象分析显示CXCR4具有显著的构象可塑性，能够通过保守残基集合与多种配体结合。CASTp分析识别出46个潜在配体结合口袋，其中口袋1因具有最大体积和表面积被选为对接位点。关键信号残基D97、D187、E288和主要配体结合残基W94、Y45等均位于该区域，为抑制剂设计提供了靶向位点。

小分子特性方面，三种候选化合物均与活性位点残基E288发生相互作用，该残基不仅对CXCR4信号传导至关重要，也在HIV-1包膜糖蛋白介导的融合中发挥作用。4990的Glide得分为-11.5，4993为-8.2，21889为-7.0，尽管得分存在差异，但后续动力学分析揭示了更为复杂的结合特性。

分子动力学模拟结果表明，膜嵌入CXCR4_4993复合物表现出最优的稳定性。RMSD分析显示其偏差最低(约0.60 nm)，且关键残基D97、D187、E288的波动幅度最小。RMSF图谱进一步证实4993结合后蛋白骨架波动性降低，尤其在活性位点区域更为明显。

氢键分析显示CXCR4_4993维持着最稳定的氢键网络，在整个200 ns模拟过程中保持2个氢键。势能计算进一步支持4993的优越性，其势能值为-2.98578e+06，介于其他两个复合物之间，表明具有适中的能量状态。

主成分分析(PCA) 揭示了不同复合物的构象采样特征。CXCR4_4993的总方差最小(999.288 nm2)，轨迹分布最为紧凑(3300 nm2)，表明4993能够有效限制受体构象波动，诱导结构性稳定。相比之下，apo CXCR4显示出最广泛的构象采样空间(8400 nm2)，反映其内在灵活性。

自由能景观(FEL) 分析显示CXCR4_4993具有两个主导能量盆地，包括一个明确的全局最小值(-29.0 kcal/mol)和一个次級盆地(-13.0 kcal/mol)，两者被16 kcal/mol的高能垒分隔。这种能量分布特征表明4993能够将受体稳定在有限数量的构象状态，有利于功能性抑制。

残基分解分析深入揭示了配体-受体相互作用的分子基础。MM/PBSA计算表明，4993与关键残基Asp187、Arg188、Gln200和Glu288产生最强的能量贡献，这些残基对CXCR4信号传导至关重要。侧链分解(SDC)分析进一步证实了这些残基在结合中的核心作用。

膜特性分析为理解配体结合对膜环境的影响提供了重要视角。面积每脂质(Area per lipid)分析显示所有系统均达到平衡状态，POPC脂质的平均面积约为69.7 ?2。膜厚度分析表明CXCR4_4993复合物具有最低的平均厚度(38.521 ?)，可能反映了配体结合诱导的膜结构调整。

脂质倾斜角分析显示，所有复合物中PN倾斜角的最高密度均出现在95°附近，而sn-2酰基链(C22-C218)倾斜角在155°达到峰值，表明配体结合对脂质取向影响有限。段碳-氘序参数(SCD)分析证实sn-1酰基链为饱和链，而sn-2链为不饱和链，这一特征在所有系统中保持一致。

讨论与结论部分强调，本研究通过系统的计算生物学方法揭示了化合物4993作为CXCR4抑制剂的显著优势。其结合模式由中央哌嗪环的质子化氮与Asp262形成的盐桥作为关键静电锚定，同时二醇部分与Arg188的氢键增强了结合特异性。疏水核心与Tyr255、Ile259、Ile284等残基的范德华相互作用进一步稳定了结合构象。

值得注意的是，4993不仅与受体形成稳定相互作用，还通过维持膜厚度、脂质间插等膜物理特性，间接支持了蛋白-脂质环境的稳定性。这种双重作用机制可能有助于其在体内环境中保持更持久的药理效应。

尽管本研究提供了强有力的计算证据支持4993作为CXCR4抑制剂的潜力，但作者强调这并不暗示已确认的治疗效果。未来需要通过体外和体内实验验证其实际疗效、安全性和药理特性。特别是需要评估4993在肾纤维化动物模型中的功能效应，以及其对于CXCR4下游信号通路(如JAK/STAT/GSK3β/β-catenin轴)的具体调控机制。

这项研究的创新之处在于首次全面评估了小分子化合物与膜嵌入CXCR4的相互作用动力学，为理性设计靶向GPCR的抑制剂提供了新范式。通过整合AlphaFold预测结构、膜环境模拟和多种分析技术，建立了从虚拟筛选到动力学验证的系统研究流程，对未来开发针对CXCR4相关疾病(包括肾纤维化、癌症和炎症性疾病)的治疗策略具有重要指导意义。