综述：mRNA-脂质纳米颗粒的效价和毒性临床前评估：当前实践与未来方向

《In vitro models》：Pre-clinical evaluation of mRNA-lipid nanoparticles’ potency and toxicity: current practices and future directions

本综述系统梳理了mRNA-LNP效价与毒性评估的最新进展，重点探讨了从传统2D单层培养到新型3D模型（如类器官、器官芯片）及计算方法的演进。文章指出，尽管缺乏统一指南，但开发能更好预测人体反应的新型替代方法（NAMs）对加速安全有效的RNA疗法至关重要，尤其强调了共培养、3D模型及人工智能在优化LNP设计中的应用潜力。

　　

mRNA-LNP疗法的崛起与评估挑战

基于信使RNA（mRNA）的技术，尤其在COVID-19疫苗成功的推动下，为多种疾病的预防和治疗带来了广阔前景。RNA疗法的有效性高度依赖于递送系统将核酸运送到靶细胞的能力，而脂质纳米颗粒（LNPs）已成为临床应用中最主要的RNA递送平台。然而，目前尚无官方指南明确定义mRNA治疗产品全球上市所需的标准，这导致用于评估RNA-LNP效价和细胞毒性的体外试验多种多样，缺乏一致性。

保证产品质量的全面表征

药物产品（fDP）的全面表征对于确保治疗可靠性至关重要。在RNA疫苗开发中，需要对药物物质（DS）（即RNA）和fDP（即最终配方的RNA）进行表征。效价测定是关键质量属性，能证明抗原的功能完整性，并支持批次间一致性和稳定性的监测。除了效价测定，由于先天免疫系统对RNA分子和LNP组分高度敏感，还需评估其毒性及引发的炎症反应。

当前实践：用于mRNA-LNP评估的二维单层培养

RNA-LNP的功能性和细胞毒性通常使用永生化细胞系或原代人类细胞的体外模型进行评估。永生化细胞系因其持续生长和无限增殖的能力而便于研究，但其与体内环境的差异可能导致结果难以转化。原代人类细胞直接从组织中分离，更接近人体生理状态，但操作更为复杂。效价评估通常采用流式细胞术、荧光显微镜或荧光素酶报告基因检测等方法。研究表明，转染水平取决于脂质、RNA序列和细胞类型。此外，对RNA-LNP细胞内运输（包括细胞摄取和内体逃逸）的研究对于理解其作用机制至关重要，常用技术包括共聚焦显微镜、超分辨率光学成像（如STED、SMLM）和荧光共振能量转移（FRET）等。

mRNA-LNP的体外毒性评估

细胞毒性需要通过MTT比色法、乳酸脱氢酶（LDH）测定等方法进行评估。mRNA疫苗可能触发先天免疫反应，即使没有mRNA，LNPs也能激活免疫细胞，发挥佐剂作用并释放促炎细胞因子（如IL-1、IL-6、TNF-α）。因此，评估炎症通路（如IRF、NF-κB）的激活和促炎细胞因子的释放至关重要。此外，mRNA-LNP与人体血液成分的相容性评估（如溶血、血小板聚集、补体激活）对于确保其安全性也极为重要。

2D单层培养模型的局限性

2D单层模型缺乏结构复杂性和生物异质性，因此对治疗药物的生理反应代表性不足。研究表明，体外与体内实验结果相关性较差。虽然体内动物模型能在更复杂的环境中评估疗法，但与人类生物体仍存在明显差异，例如物种间器官质量比和免疫反应的差异。这些局限性推动了对新型替代方法的需求。

迈向更具预测性的模型：共培养与3D体外模型

共培养模型（直接或间接/Transwell）提供了比2D单培养更接近生理相关的模型。例如，直接共培养人骨骼肌细胞和单核细胞可模拟肌肉内疫苗接种环境，增强抗原呈递细胞标记和促炎细胞因子释放。

复杂的体外模型（CIVMs），包括球体、基质包埋培养、类器官、3D生物打印和器官芯片（OOC），代表了更有前景的工具。球体模型是简单的3D培养模型，已用于研究纳米颗粒的毒性和mRNA-LNP的穿透性。基质包埋培养通过添加细胞外基质（ECM）成分，更接近体内环境。类器官是由干细胞衍生的3D结构，能高度模拟体内特性。3D生物打印则能模仿天然组织的结构和功能。器官芯片可在微流体芯片上重现器官的关键特征和流体环境，例如，人淋巴滤泡芯片可用于评估疫苗的免疫反应。这些模型能更好地模拟组织架构、细胞相互作用和微环境条件，填补了传统体外测试与动物模型之间的空白。

迈向体内替代模型

在3R原则（替代、减少、优化）背景下，绒毛尿囊膜（CAM） assay 和斑马鱼模型作为替代方案受到关注。CAM assay 可用于研究血管化、损伤和刺激性。斑马鱼模型具有与人类遗传相似性高、繁殖快、胚胎透明等优点，已用于评估mRNA-LNP的效价、毒性、生物分布和理性设计。

用于预测RNA-LNP效价和毒性的计算机模型

生物信息学和人工智能（AI）工具可用于优化治疗剂（如生物制剂、免疫调节剂、疫苗、载体）的设计，例如预测T细胞表位、蛋白质结构、物理化学特性以及个性化医疗开发。机器学习（ML）工具在纳米医学领域的应用，例如预测PLGA NPs的细胞内在化或金NPs的生物分布，显示出巨大潜力。机器学习也已用于分析LNP配方数据集，以寻找脂质组成与转染结果之间的联系，以及筛选新的可离子化脂质。将计算机免疫信息学工具、体外/体内免疫系统技术和机器学习工具整合到整个治疗开发 pipeline 中，将有助于加速安全有效免疫疗法的开发。

结论

mRNA-LNP的体外评估方法多种多样，但缺乏标准化。2D模型预测性有限，而新兴的3D模型、替代生物模型和计算机方法有望弥合体外研究与动物研究之间的差距，提供更具人体预测性的数据。协作制定清晰、统一的新型替代方法（NAMs）评估和验证标准，将加速其监管接受度，最终推动mRNA技术在临床上的成功应用。