综述：RNA测序在卵巢癌研究中的全面综述

《Journal of Ovarian Research》：RNA sequencing in ovarian cancer research: a comprehensive review

本综述系统阐述了RNA测序（RNA-seq）技术（包括单细胞RNA测序scRNA-seq和空间转录组学等）在卵巢癌（OC）研究中的革命性应用。文章详细分析了RNA-seq在揭示卵巢癌起源（如输卵管上皮FTE假说）、肿瘤异质性、化疗耐药机制（如铂类耐药）和肿瘤微环境（TME）免疫抑制特性（如癌症相关成纤维细胞CAFs、肿瘤相关巨噬细胞TAMs的作用）等方面的关键发现，并探讨了其在生物标志物发现、预后分层（如基于谷氨酰胺代谢预后指数GMPI）和免疫治疗（如免疫检查点抑制剂ICIs的应用前景）中的转化潜力，同时指出了技术挑战与未来方向。

　　

RNA测序技术概览

RNA测序（RNA-seq）技术已彻底改变分子生物学研究范式，为卵巢癌（OC）这种高致死性、高度异质性的疾病提供了前所未有的洞察力。从传统的批量RNA-seq（Bulk RNA-seq）到高分辨率的单细胞RNA测序（scRNA-seq），再到能够保留空间位置信息的空间转录组学（Spatially Resolved Transcriptomics, SRT），以及新兴的长读长测序（Long-read sequencing, LRS）和单细胞多组学技术，这些方法共同构成了解析卵巢癌复杂生物学特性的强大工具集。

批量RNA-seq因其经济高效和高通量的特点，至今仍在大型队列分析（如癌症基因组图谱TCGA）中发挥着重要作用，可用于识别分子亚型、预后生物标志物和致癌驱动基因。例如，对489例高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的批量RNA-seq分析将其分为四种分子亚型：免疫型、间质型、分化型和增殖型，为个性化治疗策略奠定了基础。

然而，批量RNA-seq提供的是细胞群体的平均表达谱，无法揭示关键的细胞异质性。scRNA-seq技术的出现突破了这一限制，使得在单个细胞水平上分析基因表达成为可能。标准的scRNA-seq工作流程包括单细胞分离（如通过荧光激活细胞分选FACS或微流控技术）、RNA反转录、cDNA扩增、文库制备、测序和数据分析。尽管面临组织解离引入的偏差、批次效应和数据高维度稀疏性等挑战，scRNA-seq已成功应用于鉴定卵巢癌中罕见的细胞亚群（如癌症干细胞）、揭示肿瘤内异质性以及解析细胞状态转换。

空间转录组学（SRT）则进一步弥补了scRNA-seq丢失空间信息的缺陷。通过基于成像（如MERFISH）或原位条形码（如10x Visium）的策略，SRT能够在完整组织架构中映射基因表达，对于研究肿瘤微环境（TME）中的细胞间通讯和空间分布模式至关重要。在卵巢癌中，SRT研究已经开始揭示与治疗反应和临床结局相关的恶性细胞和基质细胞群的空间分布异质性。

此外，长读长测序（LRS）技术（如PacBio SMRT和Oxford Nanopore）能够直接测序全长转录本，无需拼接，为识别卵巢癌中的新异构体和融合基因提供了创新方法。单细胞多组学技术则允许同时分析同一细胞的转录组、基因组和表观基因组，为解析基因型-表型关联提供了强大手段。

揭示卵巢癌的起源与早期发病机制

对细胞起源的深入理解是制定早期检测和干预策略的基础。对于最常见的HGSOC，起源于输卵管上皮（FTE）的假说已获得广泛支持，而RNA-seq技术，特别是scRNA-seq，为这一范式转变提供了高分辨率的分子证据。

scRNA-seq能够精确识别FTE中可能进展为HGSOC的祖细胞群。例如，一项关键研究对约53,000个人类输卵管细胞进行了测序，发现了一个独特的早期分泌细胞亚群。重要的是，这个特定细胞群的转录特征在晚期HGSOC肿瘤组织中仍然富集，为这些早期分泌细胞内皮细胞（ECs）可能是疾病的起源细胞提供了有力证据。另一项scRNA-seq研究在卵巢癌中发现了一类强烈保留纤毛细胞标志物的恶性ECs，进一步支持了“FTE起源假说”。甚至有小鼠模型研究利用scRNA-seq提出了上皮性卵巢癌（EOC）的双重起源假说，涉及FTE细胞和卵巢表面上皮（OSE）细胞。

除了识别癌细胞起源，RNA-seq在破译恶性转化早期激活的分子程序中也起着关键作用。转录组分析显示，癌细胞生长与胚胎发育之间存在关键相似性。构建卵巢癌和胚胎组织的单细胞图谱发现，几个卵巢癌亚群的基因表达模式与胚胎组织高度相似，表明卵巢癌发生可能利用了早期发育期间活跃的基本生物学通路。

克服诊断挑战：寻找生物标志物

由于缺乏可靠的早期诊断指标，约70%的卵巢癌患者确诊时已属晚期。目前广泛使用的血清癌症抗原125（CA125）检测存在明显局限性。RNA-seq技术通过识别差异表达基因（DEGs）、非编码RNA和特定细胞亚群等分子特征，在这一探索努力中扮演着核心角色。

RNA-seq通过阐明卵巢癌发展过程中涉及的分子通路，有助于发现诊断靶点。例如，对长链非编码RNA（lncRNAs）的研究检测到了在肿瘤发生初始阶段表现出失调的特定分子。OIN1（一种位于10号染色体上的长链基因间非编码RNA）在卵巢癌样本中表达显著升高，它通过帮助细胞避免程序性死亡来促进肿瘤生长。类似地，卵巢癌的缺氧微环境会触发独特的转录程序，研究人员通过RNA-seq技术发现HIF1A-AS3是一种新型缺氧诱导的lncRNA，其表达直接由HIF1A-α激活。

随着对微创检测的临床需求，该领域已决定性地转向液体活检。一项里程碑式的多中心诊断研究表明，通过对“肿瘤教育”血小板中的mRNA特征进行RNA-seq分析，可以有效区分卵巢癌患者和健康个体。scRNA-seq的高分辨率能力揭示，稀有细胞群可作为特定的诊断标志物。例如，一项研究在原发和转移病灶中都发现了一个独特的S100A9+恶性细胞亚群，其存在与患者生存期缩短相关。另一个有前景的细胞发现是关于尖端样内皮细胞（tip-like ECs）的鉴定，这些细胞特异性表达前列腺特异性膜抗原（PSMA，由FOLH1基因编码），这使其成为开发卵巢癌特异性血液诊断检测或成像技术的潜在靶点。

然而，将这些有前景的科学发现转化为广泛采用的诊断工具仍然面临挑战：需要在大规模前瞻性研究中彻底验证；将复杂的测序数据转化为简单、可靠且成本效益高的检测方法；肿瘤异质性对生物标志物准确性的影响；以及最关键的是，证明它们相较于现有标准能为患者带来真正的优势。

预测患者结局：预后分层

卵巢癌显著的异质性导致患者结局存在巨大差异。RNA-seq技术通过揭示预后的分子基础，为传统的病理评估提供了强有力的补充。

肿瘤微环境（TME）的细胞组成和空间分布是影响患者生存的关键因素。单细胞和空间RNA-seq技术是分析这种复杂性并识别具有相反预后影响的基质细胞群的理想工具。例如，一项对初治HGSOC肿瘤的scRNA-seq研究确定了六个与临床结局相关的细胞亚群，其中五个（包括特定的间皮细胞、肌成纤维细胞、TGF-β激活的癌症相关成纤维细胞CAFs、肿瘤特异性亚群和淋巴ECs）与较差的生存相关，而一个浆细胞群则被确定为有利的预后指标。空间转录组学研究进一步深化了这一理解，表明特定的CAF-肿瘤串扰信号网络与患者长期生存（超过10年）相关。

卵巢癌在遗传、细胞和代谢水平上表现出显著的异质性，这种高度复杂性直接导致治疗结果不佳和患者预后差异。scRNA-seq研究揭示，HGSOC肿瘤由具有独特拷贝数变异（CNVs）和转录组谱的多个亚克隆组成。这些亚克隆的存在和比例丰度是疾病进展和患者生存的关键决定因素。除了遗传因素，代谢重编程也是导致功能差异的重要原因。基于谷氨酰胺代谢相关基因对患者进行分类，可以将其分为具有显著不同生存率和免疫浸润模式的亚型，由此产生的谷氨酰胺代谢预后指数（GMPI）可以识别出总生存期较差且对免疫治疗反应减弱的高危患者。同样，糖酵解相关基因特征可以勾勒出一个高危肿瘤亚群，而包含铜死亡相关基因（如WASF2, CLDN4）的多基因预后模型在预测患者总生存期和肿瘤免疫特征方面显示出潜力。

卵巢癌的转录景观受到表观遗传和转录失调的显著影响，这反过来为预后洞察提供了丰富的来源。整合的多组学分析揭示了临床相关的表观遗传驱动因素。结合RNA-seq和ChIP-seq的研究表明，EZH2通过非经典机制——转录激活IDH2以增强TCA循环活性——来促进肿瘤生长。这种EZH2-IDH2轴不仅代表了肿瘤进展的机制驱动因素，也是一个潜在的预后指标和治疗靶点。同样，由RNA修饰（如m⁶A）介导的表观转录组调控与侵袭性疾病行为相关。整合mRNA测序和m⁶A分析发现KREMEN2是m⁶A去甲基化酶FTO和阅读器蛋白IGF2BP1稳定的关键靶点，形成了一个促进转移的调控环路。

破解与克服治疗耐药

铂类化疗仍是卵巢癌系统性治疗的基石。然而，高达75%的晚期HGSOC患者会产生耐药性，尤其是对铂类药物，这通常导致疾病复发并将总生存期缩短至仅12-14个月。RNA-seq技术通过深入分析耐药的复杂机制、识别预测性生物标志物，为制定新的治疗策略提供了重要依据。

RNA-seq有助于识别癌细胞内部赋予耐药性的基因表达程序和细胞状态。对化疗前后肿瘤样本的比较转录组分析表明，化疗本身会诱导适应性改变。在HGSOC患者中，研究发现化疗诱导了AP-1转录因子家族（如FOS, FOSB）的过表达，以及在耐药组织中11号染色体q23.1（包含SIK2基因）处反复出现的基因组扩增。除了特定基因，scRNA-seq揭示了预先存在或治疗诱导的细胞状态是耐药性的关键决定因素。一项对配对HGSOC样本的前瞻性研究确定了化疗后富集的一个与应激相关的细胞表型，该表型与较差的结局相关。另一项scRNA-seq研究表明，铂类耐药肿瘤可能含有更高比例、G2/M期活性降低的癌细胞，提示化疗诱导的静息状态可能是一种生存机制。此外，scRNA-seq还识别了与治疗反应相关的特定恶性细胞亚群。例如，一个高度增殖的TOP2A+亚群与新辅助化疗（NACT）敏感性相关。相反，一个以干扰素应答基因（如IFI6）为特征的复发性上皮亚群（S1亚型）通过NF-κB介导的凋亡抑制与铂类耐药相关。

肿瘤微环境（TME）是促进治疗耐药的关键因素。scRNA-seq研究一致表明，化疗深刻重塑了基质和免疫细胞的组成。一个关键发现是化疗后癌症相关成纤维细胞（CAFs）的显著扩增和持续存在。这些耐药的成纤维细胞通过包括YAP1在内的信号通路抑制抗肿瘤免疫，从而为肿瘤细胞构建了一个保护性生态位。CAFs也通过直接抑制免疫机制诱导治疗耐药。其中，特定的亚型如促癌的CAF_c1表达免疫调节因子（如STAT1, IRF1），并通过配体-受体对（如CD55-ADGRE5）与免疫细胞相互作用。这些特征与较差的患者预后和免疫检查点抑制剂（ICIs）反应降低密切相关。多组学研究进一步揭示，CAF亚群通过分泌因子（如IL-8）和非经典免疫检查点（如VSIG4）促进免疫抑制环境，从而损害T细胞活性。免疫细胞本身构成了治疗耐药的根本原因。卵巢癌中的T细胞表现出严重的功能耗竭和空间隔离。耗竭T细胞特征是高SPP1表达，聚集在免疫抑制 niches 中，并与不良预后相关。此外功能失调的T细胞通常被隔离在原发病灶，而转移灶则富含无反应的旁观者T细胞，形成了抵抗免疫治疗的“免疫冷区”。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）进一步强化了这种免疫抑制状态。腹水中的M2型巨噬细胞表达一系列共抑制受体（TIGIT, TIM-3, LAG-3, PD-1），体外研究表明靶向TIGIT可以重编程它们并增强其吞噬功能，这为克服治疗耐药提供了联合策略。

肿瘤的基因组景观在TME和治疗敏感性中起着主导作用。RNA-seq分析阐明了不同的基因突变模式如何产生各种免疫逃逸和耐药机制。例如，具有同源重组缺陷（HRD）的肿瘤（包括BRCA1/2基因突变）通常表现出炎症但功能失调的TME，其特征是T细胞耗竭和HLA丢失，导致对单一ICIs的耐药。这种理解为PARP抑制剂（PARPi）的开发铺平了道路，其通过“合成致死”机制利用HRD脆弱性。然而，PARPi耐药（通常通过HR功能恢复）仍然是一个重大挑战，促使人们探索包括抗血管生成药物、ICIs和其他靶向药物在内的联合疗法。相比之下，ARID1A等基因的突变可能会增强肿瘤的免疫原性。ARID1A缺失会触发cGAS-STING信号通路，诱导I型干扰素特征并招募CD8+ T细胞。对卵巢透明细胞癌（OCCC）组织的scRNA-seq研究表明，ARID1A突变塑造了一个高度浸润免疫细胞的肿瘤微环境，尤其以丰富的CXCL13、CTLA4和CD8 T细胞为特征，这一特征与对ICIs的增强反应密切相关。

设计免疫反应：免疫治疗的见解

卵巢癌由于其低突变负荷、多变的免疫细胞浸润和致密的基质结构，对免疫治疗尤其困难。RNA-seq，特别是scRNA-seq的最新进展开始改变这一局面。这些方法使研究人员能够创建更详细的“细胞图谱”，揭示免疫反应可被增强的新方面。

该项目始于对肿瘤免疫微环境（TIME）的详细普查。scRNA-seq可以揭示卵巢癌复杂的细胞景观，并识别特定细胞群内潜在的治疗脆弱性。例如，对T细胞的详细分析描绘了一个从效应状态向严重耗竭状态过渡的功能失调谱系。空间转录组学进一步证实，耗竭T细胞主要聚集在免疫抑制 niches 中，而功能失调的T细胞和无反应的旁观者细胞分别优先位于原发部位和转移灶。除了适应性免疫，髓系区室表现出显著的可塑性。值得注意的是，免疫抑制性的M2样TAMs表达多种共抑制受体（如TIGIT, TIM-3, LAG-3, PD-1），并已被确定为免疫逃逸的关键贡献者。此外，scRNA-seq已识别出不同的CAF亚群。其中，促癌的CAF_c1群体通过免疫调节配体抑制T细胞功能，其存在预测了对免疫检查点抑制剂（ICIs）的不良反应。

在这一蓝图的指导下，研究人员正在设计新的策略来纠正有缺陷的适应性免疫。学术界认识到T细胞耗竭伴随着多个抑制性受体的共表达，这推动了联合检查点阻断疗法的发展——从抗PD-1/PD-L1单药治疗到双靶点治疗，如同时抑制PD-1和LAG-3。在细胞治疗领域，新型CAR-T设计正在积极解决传统方法的局限性——包括在抑制性TME中易发生耗竭和持久性差。这些措施包括选择分化程度较低的T细胞亚群作为起始材料，以及通过基因工程改造抗耗竭特性。此外，在ARID1A突变肿瘤中识别出的稀有肿瘤反应性T细胞克隆——如富含CXCL13+CTLA4+CD8+ T细胞的亚型——为开发个性化TCR疗法开辟了新途径。

有效的应对策略需要重编程TME中的先天免疫和基质区室。免疫抑制性M2-TAMs的发现促使人们努力将其极化为抗肿瘤的M1表型或增强其吞噬能力。临床前研究表明，靶向TIGIT等受体不仅能促进M2-TAMs重编程，还能与促吞噬信号通路（如抗CD47疗法）产生协同作用。同时，特定CAF亚群在培育免疫抑制生态位中的关键作用使其成为重要的治疗靶点。

将基因组数据与转录组信息整合，正在推动精准免疫治疗进入一个由基因组见解指导的新时代。多组学研究揭示，尽管HRD肿瘤表现出炎症表型，但它们经常经历免疫编辑（如HLA丢失），导致T细胞功能障碍。这解释了为什么ICIs单药疗效有限。这一发现为PARPis和ICIs的联合治疗提供了理论依据，在靶向癌细胞脆弱性的同时复苏抗肿瘤免疫力。相反，研究表明ARID1A基因突变激活cGAS-STING通路，创造了一个富含免疫细胞并招募肿瘤反应性T细胞浸润的TME。因此，这种遗传特征成为预测ICIs疗效的有效生物标志物，可以实现更好的患者选择。

结论与展望

转录组测序技术已显著推进了卵巢癌研究，并成为精准医学的关键组成部分。RNA-seq技术涵盖了卵巢癌研究的方方面面：它不仅能够深入分析病理起源和肿瘤发生机制，表征复杂的TME，还能揭示表观遗传失调，识别潜在的生物标志物和治疗靶点，并阐明耐药的分子机制。过去十年，该技术生成的高分辨率分子图谱有助于更好地理解疾病异质性和细胞间通讯。

然而，将分子发现转化为临床应用仍面临重大的解释性挑战。一个主要问题是对转录组学发现进行严格验证。虽然scRNA-seq显著揭示了细胞异质性，但它易受技术假象的影响——包括组织解离诱导的应激、批次效应以及聚类和差异表达分析中的可变性。因此，确认稀有细胞群或特定细胞状态是否具有真正的生物学意义，需要通过补充技术（如空间转录组学、多重荧光成像或原位检测）进行交叉验证。最终，这些发现必须在大型、多中心、前瞻性队列研究中得到进一步证实。

在卵巢癌研究中，转录组学的进步越来越依赖于多维数据的整合。为了全面绘制疾病图谱，RNA-seq数据必须与基因组、表观遗传、蛋白质组和数字病理信息协同分析。在此背景下，人工智能（AI）和机器学习（ML）技术正逐渐成为不可或缺的分析工具。这些工具可以深入探索这些海量数据集内部和之间的复杂关联，从而预测患者预后、评估药物反应、识别新的生物标志物谱，并在整合转录组和组织病理学图像时揭示潜在模式。这种AI驱动的多组学分析将成为将海量数据转化为临床适用知识的核心途径。

空间转录组学（SRT）作为一项关键技术，桥接了单细胞分辨率和组织水平背景之间的关键差距。未来的进步必须专注于提高其空间分辨率和检测灵敏度，整合三维组织结构，并建立一个稳健的空间多组学框架。从计算角度来看，存在重大挑战；开发新的生物信息学方法对于解释复杂的空间数据并准确区分生物信号和背景噪声至关重要。

在临床实践整合方面，关键在于多方的共同努力。技术上，不仅需要改进和增强scRNA-seq技术以提高灵敏度和通量，还需要构建一个能够整合多组学数据和空间位置信息的计算分析系统。同时，至关重要的是要获得对TME内空间调控机制的更深入的科学理解。这些科学进步必须系统地转化为经过验证的诊断和预后系统，从而促进基于综合分子特征的精准分层治疗策略的发展。