山梨酸钾通过干扰细胞间通讯引发肾脏损伤：一项结合网络毒理学、机器学习、分子对接和单细胞RNA测序的研究

《iMetaMed》：Potassium Sorbate Triggers Kidney Injury via Dysregulated Intercellular Communication: A Study Combining Network Toxicology, Machine Learning, Molecular Docking, and Single-Cell RNA Sequencing

急性肾损伤（AKI）的分子机制研究，钾 sorbate（PS）通过靶向APP、MMP9等蛋白，激活氧化应激、炎症反应及细胞间通讯异常，导致肾损伤。整合网络毒理学、分子对接、单细胞测序等多维度方法揭示PS诱导AKI的新机制。

　　急性肾损伤（AKI）是一种在临床中具有重要意义的综合征，其特点是高死亡率和可能进展为慢性肾病（CKD）的风险。尽管钾 sorbate（PS）作为一种广泛使用的食品防腐剂，因其较高的安全性而被广泛应用于食品工业，但近年来的毒理学证据表明，它可能对肾脏产生潜在的毒性作用。本研究旨在通过整合多种方法，包括网络毒理学、分子对接、分子动力学模拟、机器学习和单细胞分析，全面探讨PS引发肾损伤的分子机制。研究发现，PS与关键靶点如基质金属蛋白酶9（MMP9）和淀粉样前体蛋白（APP）发生相互作用，从而影响脂质代谢和动脉粥样硬化，并激活AGE-RAGE信号通路。这些相互作用触发氧化应激、炎症反应和代谢紊乱，进而促进AKI的发生。通过机器学习筛选，APP被确认为关键调控基因。此外，单细胞分析显示，APP通过APP-CD74和APP-PTGER2配体-受体对，介导内皮细胞与免疫细胞之间的相互作用，为理解PS诱导的肾小管炎症和微环境失衡提供了新的细胞层面的证据。本研究不仅为评估PS的肾毒性提供了系统性的科学依据，还引入了一种创新的研究范式，为食品添加剂和环境毒素的安全评估，以及AKI的分子机制探索提供了新的思路。

AKI的病因复杂，通常由多种因素引起，如缺血再灌注、肾毒性药物（如化疗药物和抗生素）、严重感染、脓毒症以及衰老等。在分子层面，AKI的机制涉及炎症、氧化应激、细胞凋亡等病理生理过程，尚未完全明确。因此，有必要超越传统的研究视角，从系统层面深入探讨环境性肾毒性物质，如食品添加剂，的致病机制。PS作为食品添加剂，其安全性一直受到关注，但近期的研究表明，它可能通过多种途径在不同器官系统中表现出细胞毒性和基因毒性，包括诱导氧化应激、破坏线粒体功能和引发脂质过氧化反应。虽然肝脏和肾脏是主要的代谢和排泄器官，可能成为PS作用的靶点，但目前对于PS在肾损伤中具体分子靶点、信号通路及细胞间通讯机制的研究仍存在显著的知识空白。

网络毒理学作为系统生物学中的一种创新方法，结合了化合物靶点预测、蛋白质相互作用网络分析、通路富集、分子对接和分子动力学模拟等多种技术，有助于从全面的角度揭示化学物质的毒理学机制。相较于传统毒理学研究，网络毒理学的优势在于能够识别关键靶点、预测信号通路并构建机制网络，从而提供多维度的毒理学见解。结合机器学习算法，可以进一步筛选高通量数据中的关键生物标志物。同时，单细胞转录组分析（scRNA-seq）能够揭示细胞间通讯和细胞异质性，从而提供更高分辨率的机制证据。这种整合多种方法的研究策略已成为当代毒理学研究的新范式。

本研究设计了一种系统的方法，以阐明PS诱导肾损伤的分子机制。首先，通过网络毒理学方法识别潜在靶点，并构建蛋白质相互作用网络。接着，使用分子对接技术确认关键的结合相互作用，随后利用机器学习从临床样本数据中筛选出核心基因。为了验证这些基因在细胞微环境中的功能，进一步使用单细胞转录组数据进行分析。该研究不仅为PS的肾毒性提供了新的见解，还突显了多学科交叉整合策略在当代毒理学安全评估中的重要性和应用价值。

在初步分析PS毒性时，研究利用网络搜索算法和生物毒性预测方法，通过合适的软件工具进行预测。具体来说，使用ProTox-3.0作为初始筛选工具，以获取关于PS毒性的准确数据。该研究的机制图示如图1所示。通过搜索“Potassium sorbate”在PubChem数据库中，识别出PS的标准结构和“SMILE”字符串表示。然后，从SwissTargetPrediction、SEA Search Server和Super-PRED等数据库中收集PS的潜在靶点，并将物种范围限定为“Homo sapiens”。所有靶点概率值超过0.1的基因被整合，最终构建了一个PS靶点库。

接下来，研究通过“kidney injury”作为关键词，利用Drugbank、GeneCards和OMIM等数据库寻找与肾损伤相关的靶点。为了确保所选基因与肾损伤的强关联性，研究对GeneCards数据库的数据进行了进一步分析，将“score”标准设为中位数，并选择高于中位数的基因构建肾损伤靶点网络。由于Drugbank和OMIM数据库不提供“score”值且包含的靶点数量较少，这些数据未进一步处理。此外，研究筛选了PS靶点与肾损伤靶点之间的共同潜在靶点，并使用SRPLOT平台进行可视化，以识别PS诱导肾损伤的潜在靶点。

为了构建蛋白质相互作用网络并筛选核心靶点，研究将PS诱导肾损伤的潜在靶点输入STRING数据库，限制物种为“Homo sapiens”，设定“Minimum Required Interaction Score”为“High Confidence?>?0.7”，并配置“FDR Strictness”为“0.7”。这些参数确保了对目标基因对应的活性靶点蛋白进行分析。STRING分析结果随后被加载到网络生物学可视化软件Cytoscape 3.10.2中，该软件计算网络图中每个节点的参数并可视化分子之间的相互连接。这使得能够计算网络节点和边的拓扑特性，构建一个初始的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，该网络包含236个节点和3583条边。度（Degree）是指特定蛋白质与其他蛋白质相互作用的次数，通常用于衡量该蛋白质在网络中的重要性或中心性。蛋白质度值较高的通常被认为是网络中的关键节点，可能显著影响生物过程。研究使用MCODE（分子复合物检测）功能来识别PPI网络中的关键子网络或模块，每个PPI模块代表一个与功能相关的基因簇，具有不同的模块评分，从而根据这些评分选择关键基因。首先，基于度值对蛋白质网络进行可视化，然后通过Cytoscape 3.10.2的MCODE插件对PPI网络中的每个靶点进行评分，并选择评分最高的簇进行可视化。最终，将度值排名前21的靶点与MCODE评分排名前21的靶点的交集作为10个核心靶点，并通过SRPLOT平台进行可视化。

为了进一步探究这些靶点的生物学功能，研究使用DAVID数据库进行基因本体（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。GO分析涵盖了生物学过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）的评估，以阐明其主要的生物学功能。此外，KEGG富集分析用于揭示与PS和可能肾损伤靶点相关的显著通路，使用p-值小于0.05作为筛选标准。研究对238个潜在靶点进行了GO富集分析，得到了1032个具有统计学意义的GO条目，包括687个BP、106个CC和239个MF。根据GO富集分析结果，研究在SRPLOT平台上对这些条目进行了可视化。KEGG富集分析结果基于p-值小于或等于0.05，得到了176条显著的信号通路。研究将p-值最小的前20个基因和计数值最高的前10个基因在SRPLOT平台上进行了可视化。

随后，研究通过分子对接技术验证了PS与10个核心靶点的相互作用。首先，在PubChem数据库中搜索PS，并导出其“SDF”结构。接着，从RCSB和Uniprot数据库中获取核心蛋白的3D结构。之后，使用Autodock软件（1.5.6）进行脱水和电荷编辑，并将修改后的靶点蛋白和关键化合物导出为PDBqt文件。然后，使用Autodock Vina（1.2.x）软件进行分子对接。最后，将对接结果导入PyMOL软件（3.1.0）进行分析和可视化。分子对接结果表明，所有小分子与靶点蛋白具有良好的结合亲和力，其中MMP9表现出最有利的结合能量，表明其与PS之间存在显著的相互作用。此外，所有配体-大分子复合物之间的相互作用都通过氢键实现，确保了这些相互作用的稳定性。

为了进一步研究PS与核心靶点的相互作用，研究进行了分子动力学（MD）模拟。在模拟过程中，使用Gromacs 2022获取力场参数，并通过Gromacs的pdb2gmx工具和AutoFF网页获取参数。受体蛋白的分子参数使用Amber14sb力场建模，而配体的分子参数使用GAFF2力场建模。在系统周围添加了一个半径为1纳米的TIP3P立方水箱以进行溶剂化处理。使用gmx genion工具向系统中添加离子，以达到电中性。通过粒子网格Ewald（PME）方法处理长程静电相互作用，截断距离设置为1纳米。所有键约束通过SHAKE算法完成，分子动力学模拟的时间步长设置为1飞秒（fs）使用Verlet leapfrog算法。在模拟前，系统进行了能量优化，包括3000步的最速下降优化，随后是2000步的共轭梯度优化。优化步骤包括：首先约束溶质并最小化水分子；然后约束反离子并最小化；最后在整个系统中无约束地进行最小化。模拟在NPT条件下进行，温度为310 K，压力恒定，模拟时间为100纳秒（ns）。在模拟过程中，使用g-rmsd、g-rmsf、g-hbond、g-Rg和g-sasa工具计算均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、氢键（HBonds）、回转半径（Rg）和溶剂可及表面积（SASA）以及吉布斯自由能。通过MM-PBSA方法计算配体与靶点蛋白的结合自由能，并使用GROMACS中的g_mmpbsa包进行分析。

在机器学习分析中，研究从三个数据库下载了三个数据集：GTEx（肾皮质）、KPMP（11例AKI和16例CKD）和GEO（GSE61739）。使用Combat方法进行标准化，并通过PCA图展示批次效应的消除结果。研究使用的机器学习模型包括随机森林（RF）、支持向量机（SVM）、梯度提升机（GBM）、K-最近邻（KNN）、最小角回归（LASSO）和决策树（DT）。每个模型输出前30个重要的基因。ROC曲线用于验证每个模型的准确性，并选择最准确的模型结果与前分析中的10个关键基因进行交集分析。结果表明，APP是唯一共同的基因，提示APP是PS诱导肾损伤的关键基因。

在单细胞分析中，研究下载了两个单细胞RNA测序（scRNA-Seq）数据集，来自肾精准医学项目（KPMP）数据库（患者编号：28-12619，933-10155）。使用SingleCellAnalyst网站进行单细胞分析。首先，通过设定特征RNA的下限为20、上限为2500，并将线粒体基因比例低于20%作为质量控制标准，确保细胞质量。然后，进行数据整合，并通过UMAP图展示结果。自动细胞注释结果清晰地显示了样本中的细胞类型和分布，其中内皮细胞和免疫细胞（如单核细胞、NK细胞、B细胞等）是主要的细胞群体，为细胞间通讯分析奠定了基础。细胞间通讯分析显示，配体APP通过APP-CD74和APP-PTGER2通路与三种特定细胞类型——内皮细胞、单核细胞和NK细胞进行通讯。这种通讯信号较强，表明APP介导的内皮细胞与免疫细胞之间的交流是PS诱导肾损伤的重要机制。结合相关数据，这种通讯是通过APP-CD74和APP-PTGER2通路实现的，提示这些通路可能是未来临床干预的潜在目标。

在体外实验验证PS诱导的肾小管细胞功能障碍时，研究使用HK-2细胞（人肾小管上皮细胞系）进行CCK8和划痕实验。CCK8实验结果显示，PS暴露24小时后，与对照组相比，HK-2细胞的存活率显著降低。在低浓度（0.1–5 mM）下，PS对细胞存活率没有明显影响（存活率>80%）。当浓度增加到10 mM时，细胞存活率开始显著下降（存活率=72.3?±?4.1%，*p?p?p?p?
划痕实验用于评估PS对HK-2细胞迁移的影响（肾损伤修复的关键过程）。根据IC??结果，选择12.5和25 mM（亚IC??浓度）进行实验。在0小时，所有组的划痕宽度一致。在24小时后，对照组显示出明显的细胞迁移，划痕区域几乎被覆盖（修复率=78.2?±?5.3%）。相比之下，12.5 mM PS组的迁移显著减少，修复率降至45.7?±?4.6%（**p?p?
Western blot实验用于检测PS处理后HK-2细胞中APP蛋白的表达。APP（87/100-140 KDa）和GAPDH（36 KDa）在12.5和25 mM PS组中的条带强度比对照组明显增强（图7E）。定量分析相对蛋白表达（APP/GAPDH）表明，PS处理组中APP表达呈现浓度依赖性增加，其中25 mM组的表达水平最高（图7F）。这些结果进一步支持了APP在PS诱导肾损伤中的重要作用。

讨论部分指出，本研究通过网络毒理学和分子对接方法，系统地探讨了PS诱导肾损伤的机制。研究筛选了238个与PS诱导肾损伤相关的潜在靶点，并利用STRING数据库和细胞景观构建了这些靶点基因的相互作用网络，识别出10个关键节点，包括MMP9、MMP2、APP、PTGS2、SIRT1等，这些靶点表现出对PS的强亲和力，代表了PS诱导肾损伤的主要靶点。PS作为一种全球广泛使用的食品防腐剂，普通人群长期暴露于低剂量，这为进一步系统研究PS对人类健康的毒理学效应奠定了基础。临床中，AKI常进展为CKD并增加心血管风险；我们发现的机制（如PS-MMP9介导的细胞外基质降解、APP驱动的内皮-免疫细胞通讯）与临床AKI/CKD的关键病理特征（如肾小球基底膜损伤、间质性炎症）相符，从而将实验室发现与实际PS相关的肾损伤风险联系起来。

MMP9在细胞外基质降解中起重要作用，并与炎症和纤维化相关。PS在体内代谢为己烯酸，可能通过肾排泄导致肾小管上皮细胞的氧化应激反应。肾内活性氧（ROS）浓度的升高可触发炎症信号通路（如NF-κB），进而增加MMP9的表达。MMP9通过降解基底膜成分（如IV型胶原蛋白）破坏肾小球和肾小管的结构完整性，导致蛋白尿和组织损伤。MMP2作为锌依赖性内肽酶家族的一员，其主要功能与MMP9相似，即靶向降解关键的细胞外基质成分，并参与组织重塑、炎症反应和纤维化等病理生理过程。MMP2可裂解或激活促炎因子（如IL-1β、TNF-α）和趋化因子，放大炎症信号；同时，它可能通过释放结合在基质中的生长因子（如VEGF）影响血管通透性和炎症反应。MMP2与组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs，如TIMP2）的比例失衡可能导致细胞外基质合成与降解的失衡，加速纤维化过程。

APP在正常生理条件下参与细胞粘附、突触形成和损伤修复。它通过α-分泌酶或β-分泌酶途径被切割，生成不同的片段，其中β-分泌酶途径产生的β-淀粉样蛋白（Aβ）在阿尔茨海默病中形成脑部淀粉样斑块。PS可能通过调节APP的表达诱导肾损伤过程。已有研究表明，Aβ在肾小球或肾间质中异常积累，形成淀粉样物质，这可能进一步破坏滤过屏障，导致蛋白尿和肾功能下降。此外，APP-CD74轴促进内皮细胞与巨噬细胞之间的通讯，从而加剧肾损伤和纤维化。在临床中，CKD患者的肾组织中已观察到APP表达异常，我们的研究提示PS（一种常见的环境因素）可能与此有关，为研究特发性肾损伤提供了新的线索。同时，我们识别的APP-CD74/PTGER2轴可能成为潜在的临床干预靶点，增强研究结果的转化价值。

PTGS2是前列腺素合成过程中的关键限速酶，催化从花生四烯酸生成前列腺素，并在炎症、血管调节和细胞保护中发挥重要作用。在缺血再灌注和脓毒症等AKI模型中，PTGS2被炎症因子（如TNF-α、IL-1β）诱导高表达，促进PGE?的产生并放大炎症反应。SIRT1是sirtuin家族的一员，主要参与细胞应激反应、能量代谢、抗氧化等过程，并与衰老和多种疾病相关。SIRT1通过去乙酰化蛋白质（如FoxO和PGC-1α）激活抗氧化通路（如SOD、CAT、GSH-Px），减少ROS的积累。过量的PS可能抑制SIRT1的表达或活性，导致抗氧化能力下降、ROS过度积累以及肾小管上皮细胞的氧化损伤。SIRT1通过去乙酰化抑制NF-κB p65亚基的转录活性，从而减少促炎因子（如TNF-α、IL-6、IL-1β）的释放。SIRT1的抑制会导致NF-κB的过度激活，促进局部肾炎症反应，加剧肾组织损伤。SIRT1可能通过抑制TGF-β信号，减少Smad3的乙酰化和胶原沉积，从而延缓肾纤维化。SIRT1活性的降低可能激活TGF-β/SMAD3通路，促进细胞外基质（ECM）沉积，导致肾间质纤维化。

根据KEGG通路富集分析结果，PS可能通过多种通路诱导肾损伤，包括癌症相关通路、脂质代谢和动脉粥样硬化、前列腺癌以及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路。近年来，多项研究揭示了肾癌与肾损伤之间的密切关联。作为肾癌的一种常见并发症，肾损伤的机制与抗肿瘤药物的肾毒性密切相关。PS可能通过类似的机制诱导肾损伤，并且其作用机制与抗肿瘤药物的肾毒性相似。在分子机制层面，PS的代谢过程中产生的ROS不仅可能诱导类似前列腺癌特征的氧化应激反应，还可能激活NF-κB信号级联，诱导促炎因子（如IL-6和TNF-α）的表达，驱动炎症细胞向肾间质迁移。这种持续的炎症微环境可能促进细胞外基质重塑，最终导致不可逆的肾间质纤维化。值得注意的是，在病理演变过程中，PS可能通过调节COX-2/PGE2通路，导致前列腺素代谢失衡。这种失衡状态不仅会加剧现有的炎症级联反应，还可能通过正反馈机制促进下游信号分子（如PGE2受体EP4）的异常激活，形成促纤维化的恶性循环，从而加重肾的病理过程。

在糖尿病相关的病理机制中，AGEs（晚期糖基化终产物）作为持续高血糖的特征性代谢产物，通过与特定受体RAGE结合，介导关键的信号转导事件。PS可能通过诱导氧化损伤和炎症反应参与这一通路的调节。特别值得注意的是，已有研究表明，AGEs-RAGE信号轴在糖尿病肾病的进展中起核心调控作用，并通过上调TGF-β1的表达加剧疾病进程。进一步的研究显示，在糖尿病肾病的微环境中，TGF-β1作为关键的促纤维化因子，通过诱导肾小球系膜细胞中细胞外基质的异常积累，推动肾间质纤维化的发生，最终导致肾结构重塑和功能逐渐恶化。上述分子事件的级联反应系统地揭示了糖尿病肾损伤的核心病理机制。尽管本研究提供了系统性的见解，但仍存在一些局限性需要讨论。首先，计算预测可能存在偏差：网络毒理学中的初始靶点筛选依赖于SwissTargetPrediction和GeneCards等数据库。这些数据库基于序列同源性、化学结构相似性或现有文献关联进行预测，可能带有假阳性风险。例如，一些预测的PS-靶点相互作用可能缺乏直接的体内验证，且低丰度或组织特异性靶点（如肾特异性转运蛋白）可能被低估。尽管通过PPI网络拓扑分析（度/MCODE评分）和分子对接验证减少了假阳性，但仍无法完全排除残留的偏差。其次，数据库的局限性：GeneCards和OMIM数据库中与肾损伤相关的靶点主要来源于对常见病因（如缺血再灌注、药物肾毒性）的研究，而关于食品添加剂诱导肾病的数据较少。这可能导致PS介导的肾损伤特异性靶点的低估，从而限制了所识别机制的范围。第三，体外实验的局限性：目前的验证主要依赖于HK-2细胞（一种肾小管上皮细胞系），无法完全模拟体内复杂的肾微环境（如与肾小球细胞的相互作用、免疫细胞浸润或系统代谢调控）。未来的研究应结合动物模型（如PS处理的小鼠）来验证研究结果的转化价值。

综上所述，本研究通过整合网络毒理学、分子对接、机器学习和单细胞分析，全面阐明了PS诱导AKI的分子机制。研究发现，PS可能通过关键的病理过程（如氧化应激和炎症反应）直接与核心靶点如MMP9和APP相互作用，从而影响脂质代谢和AGE-RAGE信号通路，导致肾细胞代谢功能障碍和微环境失衡，进而引发AKI。此外，研究创新性地识别出APP作为核心介质，为理解PS诱导的AKI提供了新的细胞生物学视角。本研究不仅加深了我们对食品添加剂肾毒性的理解，还为探索AKI的分子机制和早期预警标志提供了新的理论基础和研究方法。