利用乳源性小细胞外囊泡进行塞马格鲁肽和替泽帕肽的口服递送

《Journal of Extracellular Biology》：Oral Delivery of Semaglutide and Tirzepatide Using Milk-Derived Small Extracellular Vesicles

口服GLP-1受体激动剂递送系统研究：牛奶来源sEVs显著提升semaglutide和tirzepatide口服生物利用度，通过延长胃肠驻留时间实现长效降糖效果，为多肽药物口服递送提供普适性解决方案。

　　治疗性蛋白质和肽药物在现代生物医学领域引发了革命性的变化，然而，它们的口服给药仍然面临诸多挑战。胃肠道中的酶降解和黏液屏障是限制肽类药物口服吸收的主要因素。近年来，研究人员开始探索新的策略，以克服这些障碍并实现更高效的口服递送。小的细胞外囊泡（sEVs）因其天然来源、生物相容性好、免疫原性低以及能够穿越黏液和细胞屏障等特性，被认为是一种有前景的下一代口服递送载体。本研究首次成功利用源自乳制品的小型细胞外囊泡，实现了两种GLP-1受体激动剂（GLP-1RAs）——Semaglutide和尚未广泛应用的Tirzepatide的口服递送，并在糖尿病模型中验证了其显著的血糖降低效果。

### 背景与挑战

自胰岛素被发现用于治疗糖尿病以来，已有超过80种肽类药物被批准用于治疗糖尿病、癌症、骨质疏松等疾病。然而，肽类药物普遍面临低口服生物利用度的问题，这使得它们主要依赖于侵入性的注射方式。尽管研究人员致力于开发有效的口服递送系统，但至今仅有少数肽类药物实现了口服给药，并且其生物利用度通常低于1%。低生物利用度不仅影响药物疗效，还导致需要更高剂量和更频繁给药，从而增加了患者的经济负担。

目前，首个获批用于口服给药的GLP-1RA是Semaglutide，它通过使用SNAC作为辅料，避免了胃蛋白酶的降解并提高了胃部吸收率。然而，尽管SNAC技术在Semaglutide的口服递送中发挥了重要作用，但其在其他结构相似的肽类药物中的应用效果有限。此外，虽然Semaglutide的口服制剂在临床试验中表现出一定的血糖控制效果，但其生物利用度仍然较低，且其口服制剂需要每日服用，而注射剂则可每周使用一次。这表明，开发一种高效、便捷且适用于多种肽类药物的口服递送系统，对于提高患者依从性和降低治疗成本具有重要意义。

### sEVs作为新型口服递送载体

细胞外囊泡（EVs）是一类由细胞分泌的天然纳米颗粒，它们在细胞间通讯中发挥着关键作用，携带多种信号分子，参与多种生理和病理过程。sEVs因其天然来源、结构稳定性和生物相容性，被认为是下一代药物递送系统的理想候选者。sEVs可以从多种来源提取，包括乳制品、植物和细胞系。其中，乳制品来源的sEVs因其低免疫原性和高稳定性，成为研究的重点。

本研究中，我们选择了脱脂乳来源的sEVs作为口服递送载体。通过比较不同来源的sEVs（包括全乳、脱脂乳和椰子水，以及293F细胞来源的EVs），我们发现脱脂乳来源的sEVs在产量、形态和纯度方面表现最佳。具体而言，脱脂乳sEVs的产量高达10¹¹个/毫升，而全乳sEVs的产量稍低。同时，脱脂乳sEVs的形态呈现典型的“杯状”结构，且其膜结构清晰，显示出良好的稳定性。这些特性使脱脂乳sEVs成为理想的口服药物载体。

### sEVs对肽药物的负载与释放

为了评估sEVs对Semaglutide和Tirzepatide的负载效率，我们采用了多种方法，包括室温孵育、超声处理、挤出法、冻融循环和皂苷处理。其中，室温孵育法显示出最高的负载效率，分别为Semaglutide的56.4%和Tirzepatide的23%。此外，室温孵育法还实现了较高的正向负载率（94.9%），表明大多数sEVs成功结合了药物。通过超分辨率显微成像，我们进一步确认了药物与sEVs的共定位现象，表明药物主要分布在sEVs的表面，而非内部空腔。

值得注意的是，Semaglutide和Tirzepatide的结构中都包含一个长的化学修饰脂质尾部。我们推测，这种脂质尾部可能通过插入sEV膜中实现药物的负载，从而使肽部分暴露于囊泡表面，而不是包裹在囊泡内部。这一机制在EV药物负载中已被广泛报道，并且已被证实能够有效提高药物的稳定性和生物利用度。

### 体外与体内的活性评估

为了评估sEVs递送的Semaglutide和Tirzepatide的体外和体内活性，我们使用了表达人GLP-1受体（hGLP-1R）并结合CRE驱动萤火虫荧光素酶的293细胞进行细胞活性测试。结果显示，sEVs负载的Semaglutide和Tirzepatide在激活hGLP-1R方面表现出与游离肽相似的EC₅₀值，表明其生物活性没有受到显著影响。此外，通过体外试验，我们还发现sEVs负载的Semaglutide在小鼠模型中能够有效降低血糖水平，且效果持续时间较长。

在体内实验中，我们采用液体制剂和胶囊制剂两种形式对Semaglutide和Tirzepatide进行递送。结果表明，与液体制剂相比，胶囊制剂的sEVs在体内具有更长的半衰期，且在胃肠道中停留时间更久。这可能是由于胶囊形式能够保护sEVs免受消化酶的破坏，从而提高其在体内的稳定性和递送效率。此外，通过活体成像技术，我们发现胶囊制剂的sEVs在体内信号强度显著高于液体制剂，表明其在体内具有更长的存留时间。

### sEVs与传统技术的比较

与现有的SNAC技术相比，sEVs平台展现出更广泛的应用潜力和更高的灵活性。SNAC技术仅适用于Semaglutide，而无法有效递送其他结构相似的肽类药物，这限制了其在多靶点治疗药物中的应用。相比之下，sEVs能够有效负载Semaglutide和Tirzepatide，并在体内表现出良好的递送效果。这表明，sEVs可能是一种更通用的口服递送载体，能够克服传统技术的局限性。

此外，我们发现，尽管Tirzepatide的分子量较大且亲水性较强，导致其负载效率低于Semaglutide，但其在体内的药效表现更为显著。这说明，即使在负载效率较低的情况下，sEVs仍然能够有效提高药物的生物利用度。因此，sEVs可能成为一种更具优势的口服递送系统，尤其是在处理结构复杂、亲水性强的药物时。

### 潜在的临床应用与挑战

尽管sEVs在口服递送方面展现出显著的潜力，但其在临床转化过程中仍面临一些挑战。首先，需要进一步优化sEVs的制备工艺，以确保其在大规模生产中的稳定性和一致性。其次，如何在保证药物负载效率的同时，提高sEVs的体外和体内稳定性，是实现其商业化的重要环节。此外，关于sEVs在体内靶向作用机制的研究仍需深入，以明确其在胃肠道中的吸收途径和靶向细胞。

从监管角度来看，EVs作为药物载体仍缺乏明确的指导方针，这给其在临床试验和审批过程中带来了不确定性。然而，随着EVs在药物递送中的研究不断深入，相关法规也在逐步完善。我们相信，随着技术的成熟和研究的深入，sEVs有望成为一种广泛应用的口服药物递送系统。

### 展望与未来方向

本研究不仅验证了sEVs在口服递送中的可行性，还为其在更广泛的肽类药物中的应用提供了依据。通过优化负载方法和配方设计，我们有望进一步提高sEVs的负载效率，并增强其在体内的稳定性。此外，探索更先进的递送系统，如层叠自组装或水凝胶技术，可能为sEVs的口服递送提供新的解决方案。

未来的研究可以聚焦于如何提高sEVs的药物负载效率，特别是在处理亲水性强、分子量较大的药物时。同时，需要进一步研究sEVs在体内作用的分子机制，包括其如何穿越黏液屏障、如何被吸收以及如何在体内发挥作用。此外，探索sEVs在其他疾病治疗中的应用，如癌症或代谢性疾病，也将是未来的重要方向。

综上所述，sEVs作为一种新型的口服递送载体，具有广阔的应用前景。通过进一步优化其制备工艺和递送方法，我们相信sEVs将为肽类药物的口服给药提供一种高效、安全且可持续的解决方案，从而推动药物递送技术的革新。