综述：通过传统的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）降低乙醇发酵过程中甘油产生的工业策略

《Biofuels, Bioproducts and Biorefining》：Industrial strategies to minimize glycerol formation in ethanol fermentation by conventional Saccharomyces cerevisiae

本文综述了通过控制底物浓度、温度、pH、盐分及酵母菌株适应工业发酵条件等操作参数，减少乙醇发酵中甘油生成的研究，以提高乙醇产率和过程可持续性。

　　工业乙醇生产面临的一个重要挑战是平衡代谢效率与减少副产物的生成，特别是甘油。甘油的形成在渗透压、温度、氧化和营养压力等条件下被显著增强，尽管它对酵母细胞的生存具有重要作用，但其合成却直接降低了乙醇的产量，并对整个工艺的经济可行性产生负面影响。因此，如何有效控制甘油的生成，是提升乙醇发酵效率和可持续性的关键问题。本文旨在综述和整理适用于工业生产环境的操作策略，这些策略基于酵母的生理机制和第一代乙醇工厂的实际限制，强调通过整合多种操作方法，能够更有效地减少甘油生成并优化碳利用效率。此外，文章还简要介绍了代谢工程作为辅助手段的潜力，为未来可能的技术革新提供参考。

乙醇作为可再生能源的重要组成部分，其需求在全球范围内持续增长。在巴西和美国，乙醇生产主要依赖于玉米和甘蔗汁的酒精发酵，分别占全球总产量的28%和53%。尽管在实验室条件下酒精发酵的理论效率可以达到90%-92.5%，但在实际工业生产中，这一效率通常较低。工业发酵过程中，多种操作和环境因素如渗透压、温度波动、污染物的存在以及底物组成的变化，都会影响发酵性能。由于原材料占生产成本的很大一部分，任何提高工业产量的改进，特别是通过减少副产物如甘油，都能带来显著的经济效益。

发酵效率通常被定义为乙醇产量与底物消耗量之间的比率。这个指标不仅反映了生物化学转化的效率，还能揭示不理想的代谢路径。在酒精发酵过程中，甘油是仅次于二氧化碳的第二大副产物，其合成与酵母细胞的代谢过程密切相关。研究表明，在葡萄糖和果糖的发酵过程中，最多有5%的底物被转化为甘油。如果能减少约2%的甘油生成，理论上可使乙醇产量增加约1%。因此，即使微小的甘油合成减少，也能对工业乙醇生产带来实质性的提升。

甘油在酵母代谢中扮演多重角色，不仅作为渗透压调节剂，还在细胞的氧化还原平衡中发挥关键作用。在无氧条件下，甘油能够替代氧气参与NAD+的再生，从而维持糖酵解的连续性。这一机制在甘油-3-磷酸脱氢酶（GPD）催化下进行，而GPD的表达受到两种等位基因GPD1和GPD2的调控。GPD1主要在渗透压压力下被激活，而GPD2则对维持无氧条件下的氧化还原平衡至关重要。因此，甘油的合成不仅是酵母细胞适应环境压力的一种方式，也与细胞的生存和代谢稳定性密切相关。

在实际工业操作中，酵母细胞对渗透压和氧化压力的响应，往往通过甘油的合成来实现。高渗透压条件下，细胞会减少甘油的外排并增加其合成，以维持细胞内的水势平衡。这一过程由HOG（高渗透压甘油）通路调控，同时，酵母细胞也会通过调节膜上的水通道蛋白（如Fps1p）来控制甘油的进出。此外，甘油还具有热保护功能，能够稳定蛋白质并防止其在高温下变性。因此，甘油的生成是酵母细胞应对多种工业压力的重要机制，但其过量合成却成为影响乙醇产量的障碍。

为了减少甘油的生成，工业生产中可以采取多种策略。首先，通过控制发酵介质中的底物和乙醇浓度，可以有效降低渗透压和氧化压力，从而减少甘油的合成。例如，在分批补料发酵中，逐步供给糖分能够避免糖浓度过高导致的渗透压压力，减少酵母细胞的应激反应。同时，对于高浓度糖分的发酵，如高糖发酵（Very High Gravity, VHG），精确控制糖分的供给速率和持续时间对于减少甘油生成至关重要。此外，高浓度乙醇对酵母细胞的抑制作用也值得关注，因为乙醇浓度的升高会降低细胞活性，影响发酵效率。因此，优化糖分供给策略，例如在细胞循环系统中减少残余乙醇的回流，或在高乙醇浓度条件下使用真空蒸发和选择性膜技术，是控制甘油生成的重要手段。

其次，酵母细胞浓度的调控也是减少甘油生成的关键因素之一。酵母细胞与底物的比例如何平衡，直接影响其代谢活动和甘油合成的必要性。研究表明，细胞浓度是影响甘油生成的第二大因素，仅次于发酵时间。过高的细胞浓度可能导致代谢波动，从而增加甘油的生成。因此，合理调整初始接种量，以及通过高效离心技术维持目标细胞浓度，是优化发酵过程的重要措施。在巴西的甘蔗工业中，典型的细胞浓度范围为8%-12%，而在玉米乙醇生产中，这一范围通常为3%-4%。不同工艺对细胞浓度的需求存在差异，因此需要根据具体条件进行调整。

此外，发酵原料的成分对渗透压和氧化压力的调控具有重要影响。例如，在使用糖蜜或残渣回收的工艺中，高盐浓度会加剧渗透压压力，刺激甘油合成。因此，控制盐分的积累，如通过限制残渣回收次数、使用新鲜汁液稀释糖蜜等，是降低甘油生成的有效方法。同样，某些原料中可能含有抑制性物质，如糠醛、羟甲基糠醛、酚类、香兰素和己醇，这些物质会影响酵母的活性和代谢路径。因此，监控并控制这些抑制性物质的浓度，有助于维持更适宜的发酵环境。

发酵过程中，pH值的控制同样重要。较高的pH值会促进氧化还原失衡，从而增加甘油的生成。通过优化pH调节策略，如使用硫酸进行酵母酸处理，可以有效减少甘油的合成。同时，pH值的调整需要考虑酸添加量和处理时间，以确保酵母的活性不受影响。此外，用于酵母处理和培养的水质对发酵过程也有重要影响，含杂质或抑制性物质的水可能引发渗透压和毒性压力，进而影响酵母的代谢活动。因此，使用纯水作为酵母培养的媒介，有助于减少这些负面影响。

酵母菌株的选择和适应性也是减少甘油生成的重要策略。适应特定工艺条件的酵母菌株能够减少渗透保护反应的启动，从而降低甘油的合成。例如，在分批补料发酵中，使用先前发酵循环中适应的菌株，而非新鲜的面包酵母，可以提高生产效率。一些研究显示，使用适应性菌株能够显著降低甘油含量，如Basso等人的研究表明，适应性菌株PE-2在甘蔗发酵中的甘油生成比面包酵母减少了约2%。这种策略不仅有助于提高乙醇产量，还能减少对基因改造的依赖，从而更适合工业应用。

在代谢工程领域，已有多种策略被研究用于减少甘油的生成。例如，通过删除GPD1和GPD2基因，可以中断甘油的合成途径。然而，这些基因的缺失可能导致酵母细胞无法再生NAD+，从而影响其生长和代谢稳定性。因此，一些研究者尝试通过引入替代代谢途径，如利用二氧化碳作为电子受体，结合磷酸核酮糖激酶（PRK）和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）等酶，以实现NADH的再氧化，从而减少甘油的合成。这种方法不仅能够提高乙醇产量，还能在一定程度上降低酵母的代谢负担。

除了基因层面的调整，通过调控细胞内的ATP水平，也可以间接减少甘油的生成。ATP的过度消耗可能引发细胞为了维持代谢平衡而增加NADH的再氧化需求，进而促进甘油的合成。因此，通过减少ATP的合成或利用无功ATP降解循环，如过表达碱性磷酸酶（如Pho8），可以降低酵母对甘油的依赖。然而，这种策略需要谨慎实施，以避免细胞活性的下降和发酵效率的降低。

综上所述，甘油的生成是酵母细胞在工业发酵过程中适应多种压力的自然反应，但其过量生成会显著降低乙醇产量。因此，工业生产中需要通过一系列操作策略来控制甘油的生成，包括底物和乙醇浓度的调控、酵母细胞浓度的优化、原料成分的管理、pH值的调整以及适应性菌株的使用。这些策略的综合应用，有助于提升发酵效率和乙醇产量，同时降低生产成本，提高工艺的可持续性。此外，随着代谢工程技术的进步，未来可能通过基因改造进一步优化酵母的代谢路径，减少甘油生成并提高乙醇产量。然而，这些技术在当前工业应用中仍面临诸多挑战，如法规限制、经济成本和操作复杂性。因此，短期内更倾向于采用可操作性强、成本低的非基因改造策略，以实现更高的生产效率和经济可行性。