综述：针对猪肠道冠状病毒的黏膜疫苗设计：从抗原递送到免疫激活

《Transboundary and Emerging Diseases》：Design of Mucosal Vaccines Against Swine Enteric Coronaviruses: From Antigen Delivery to Immune Activation

猪源冠状病毒（SeCoVs）引发仔猪急性肠炎高致死，现有注射疫苗因黏膜免疫不足及母源抗体干扰效果有限。本文综述口服/鼻腔黏膜疫苗递送平台（纳米颗粒、水凝胶、工程益生菌、重组病毒载体等）及免疫激活机制（M细胞递送、树突状细胞呈递、分泌型IgA和记忆性T细胞调控），提出整合靶向递送、跨上皮转运优化及佐剂策略（如CpG、干扰素λ、天然免疫调节剂）以增强黏膜保护。

　　近年来，猪肠道冠状病毒（Swine Enteric Coronaviruses, SeCoVs）的感染已成为全球养猪业面临的重要挑战之一。这类病毒主要包括猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）、猪德尔塔冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus, PDCoV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus, TGEV）以及猪肠道α冠状病毒（Swine Enteric Alphacoronavirus, SeACoV）。其中，PEDV和PDCoV因其对新生仔猪的高致死率而备受关注。这些病毒主要通过粪-口途径传播，能够感染肠道绒毛上皮细胞，引发严重的腹泻、呕吐和脱水症状，从而导致高死亡率。自2010年以来，PEDV变异株在亚洲多个地区频繁爆发，给养猪业带来了巨大的经济损失。同样，PDCoV自2014年起在北美和亚洲部分国家出现，其对新生仔猪的致死率可达40%以上。TGEV自1946年在美国首次发现以来，其在新生仔猪中的致死率甚至高达100%。而SeACoV则于2017年在中国广东首次报道，引发了一次大规模的致命性腹泻疫情，显示出其对肠道造成严重病理损伤的能力。

目前，针对SeCoVs的疫苗主要是通过肌肉注射途径进行的，包括灭活疫苗和减毒活疫苗。这类疫苗的主要作用是诱导系统性IgG免疫应答。然而，由于新生仔猪免疫系统尚未发育成熟，其对疫苗的免疫应答能力较弱，导致现有注射疫苗在预防SeCoVs感染方面效果有限。此外，母源性抗体通过初乳传递，可能会干扰疫苗的免疫诱导过程，从而降低疫苗的保护效果。肌肉注射疫苗还难以有效激活肠道相关淋巴组织（Gut-Associated Lymphoid Tissue, GALT）和黏膜免疫应答，因此难以诱导保护性的分泌型IgA（Secretory IgA, sIgA）。在黏膜免疫系统中，sIgA是建立黏膜免疫屏障、维持肠道稳态、防止病毒扩散和疾病进展的关键因素。相比之下，口服和鼻腔黏膜疫苗能够直接激活黏膜防御机制，同时诱导局部和全身免疫应答，展现出更广泛的应用前景。

黏膜免疫系统的结构和功能在SeCoVs的感染过程中起着至关重要的作用。SeCoVs主要通过肠道感染宿主，其复制过程发生在特定的上皮细胞和免疫细胞中。这些病毒的传播途径不仅包括直接接触，还涉及空气、运输工具、饲料、人员鞋底等间接传播方式。研究表明，母猪通过乳汁传播PEDV和TGEV，使得母乳成为另一条重要的传播途径。病毒进入宿主后，主要感染小肠中的绒毛上皮细胞，其中一些研究还发现，PEDV能够感染肠道干细胞（LGR5+）和杯状细胞（MUC2+），并激活Notch信号通路，抑制杯状细胞分化，减少黏液分泌，从而加剧肠道病理损伤。尽管目前尚缺乏直接证据表明SeCoVs能够感染微褶细胞（M cells），但这些细胞作为黏膜免疫应答的门户，对于启动黏膜免疫至关重要。

猪肠道黏膜免疫系统由多种免疫细胞和组织构成，包括Peyer’s patches（PPs）、M cells、树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）和浆细胞等。PPs是GALT的重要组成部分，主要位于回肠，由多个淋巴滤泡组成，这些滤泡中富含B细胞、T细胞、DCs和巨噬细胞。PPs的滤泡相关上皮（Follicle-Associated Epithelium, FAE）中含有特殊的M cells，它们能够通过内吞作用或微胞吞作用将肠道腔内的抗原转运至下层的抗原呈递细胞（Antigen-Presenting Cells, APCs），如DCs和巨噬细胞。在PPs中，DCs捕获、处理并呈递抗原，激活初始T细胞，从而启动适应性免疫应答。激活的T细胞进一步帮助B细胞的增殖和分化，最终生成浆细胞，迁移到黏膜固有层并分泌sIgA。sIgA在胃肠道和呼吸道中结合病原体，防止其黏附和穿透上皮细胞，从而发挥关键的保护作用。

黏膜疫苗的免疫应答机制与注射疫苗存在显著差异。黏膜疫苗能够有效诱导sIgA和组织驻留记忆T细胞（Tissue-Resident Memory T cells, T_RM），这些细胞能够拦截病原体并提供即时的免疫保护。在黏膜免疫系统中，sIgA的产生是免疫防御的第一道防线，而T_RM则在病原体再次入侵时迅速响应，提供额外的细胞免疫保护。研究表明，口服或鼻腔给药的黏膜疫苗能够同时激活局部和全身免疫，形成更全面的保护屏障。在黏膜免疫过程中，T helper细胞（Th cells）和黏膜特异性细胞因子的协同作用有助于IgA类转换和IgA+浆细胞的分化，从而增强黏膜免疫的持久性和有效性。

为了提高黏膜疫苗的免疫应答效果，近年来研究人员开发了多种抗原递送平台，包括纳米颗粒（NPs）、水凝胶系统、基因工程益生菌、重组病毒载体和真核表达系统等。这些递送平台能够增强抗原的稳定性，促进其穿过上皮屏障，进入黏膜诱导部位，从而更有效地激活免疫细胞。例如，纳米颗粒具有可调节的粒径、可修饰的表面和良好的生物相容性，能够保护抗原免受胃酸和消化酶的降解，并通过其小粒径特性促进M cells和DCs的摄取。水凝胶系统因其三维网络结构和高水含量，能够稳定抗原并延长其在黏膜表面的滞留时间，从而增强免疫激活。基因工程益生菌，如乳酸杆菌（Lactobacillus casei）和乳球菌（Lactococcus lactis），能够表达或分泌异源抗原，并通过其表面的免疫配体与宿主免疫系统相互作用，从而实现持续的抗原表达和免疫刺激。重组病毒载体，如腺病毒（Adenovirus）和痘病毒（Vaccinia virus），则通过模拟自然感染途径，诱导强烈的体液和细胞免疫应答。真核表达系统，如昆虫细胞-杆状病毒表达系统（BEVS），能够产生具有正确折叠和糖基化修饰的复杂抗原，为黏膜疫苗的开发提供了基础。

在黏膜疫苗的开发过程中，抗原的靶向递送和跨上皮摄取是提高免疫效果的关键因素。M cells和DCs作为黏膜免疫应答的重要细胞，其在抗原转运和呈递中的作用不可忽视。通过设计特定的靶向配体，如RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）三肽和Co1肽，能够增强抗原与M cells和DCs表面受体的结合能力，从而提高抗原的摄取效率。此外，纳米颗粒和囊泡系统可以通过调节紧密连接蛋白（如ZO1和claudin1）的表达，提高抗原跨上皮的渗透能力，从而增强黏膜免疫激活。例如，某些修饰过的纳米颗粒能够促进DCs的招募和迁移，进而增强免疫应答。同时，DCs的靶向递送能够提高抗原的处理和呈递效率，从而促进T细胞的激活和长期免疫记忆的形成。

为了进一步提升黏膜疫苗的免疫效果，研究人员也在探索优化的佐剂策略。佐剂能够增强抗原的免疫原性，促进免疫细胞的激活，并调节Th1/Th2免疫应答的平衡。合成佐剂如CpG-寡脱氧核苷酸（CpG-ODNs）和干扰素λ1（IFN-λ1）在提高黏膜免疫方面表现出显著潜力。CpG-ODNs能够通过激活Toll样受体（TLRs）促进抗原特异性IgA的产生，同时对系统性IgG影响较小。IFN-λ1则通过增强上皮细胞的抗病毒防御能力，支持局部T细胞和B细胞的免疫记忆形成，从而为黏膜疫苗提供更持久的保护。天然化合物类佐剂如乳铁蛋白（Lactoferrin）和黄芪多糖（Astragalus Polysaccharides, APS）也显示出良好的免疫增强效果。乳铁蛋白不仅能够促进DCs的成熟，还能通过增加IL-6和B细胞激活因子（BAFF）的表达，支持IgA类转换和分泌。黄芪多糖则能够提高母猪的乳汁和黏膜IgA水平，从而增强仔猪的被动免疫能力。此外，GSLS（甘草酸）作为一种天然增强剂，能够提高DCs的吞噬能力，促进CD4+ T细胞的激活，并增强PEDV特异性IgA的产生。

尽管黏膜疫苗在预防SeCoVs感染方面展现出巨大的潜力，但其开发仍面临诸多挑战。首先，SeCoVs的快速进化导致其抗原的变异，尤其是S蛋白中的中和表位，这使得现有疫苗与流行病毒株之间的匹配度下降，从而限制了其交叉保护能力。其次，疫苗制剂需要克服肠道环境中的酶降解、胃酸和胆盐等不利因素，同时保持足够的稳定性以穿过黏膜屏障并被APCs有效摄取。此外，许多抗原递送平台存在遗传不稳定性、对胃肠道条件的高敏感性以及严格的冷链运输要求，这些因素限制了其在大规模生产中的应用。最后，某些活体细菌载体虽然能够诱导强烈的黏膜免疫应答，但其开发受到生物安全问题的制约，如无控制的定植和抗生素抗性基因的水平传播。

为了推动SeCoVs黏膜疫苗的发展，未来的研究需要在抗原设计、递送策略和评估模型方面取得突破。在抗原层面，结合保守表位和合适的佐剂有望拓宽疫苗的保护范围并延长免疫效果。在递送策略方面，优化递送平台的物理化学特性，如粒径、表面电荷和配体密度，将有助于提高抗原的稳定性、跨上皮运输效率和免疫激活效果。此外，建立精准的预测和标准化评估工具对于指导黏膜疫苗的理性设计至关重要。近年来，肠道类器官、肠道芯片系统、单细胞RNA测序和空间转录组学等新技术为研究黏膜免疫结构和疫苗诱导的免疫应答提供了前所未有的机会。这些技术能够帮助科学家更深入地理解黏膜免疫机制，并加速开发高效、持久的SeCoVs疫苗。

综上所述，口服和鼻腔黏膜疫苗是控制SeCoVs感染的有前景策略，其成功依赖于能够有效保护抗原并将其递送至免疫诱导部位的平台，以及能够激活免疫应答的机制。有效的黏膜免疫激活需要诱导sIgA、T_RM和GC B细胞反应，这些反应共同作用，限制病毒复制，阻断传播并提供持久的免疫保护。此外，佐剂的合理使用可以进一步增强免疫应答，提高疫苗的整体效果。未来，将优化的递送系统与合理的免疫激活策略相结合，将是开发安全、有效且具有广泛保护性的SeCoVs黏膜疫苗的关键所在。通过不断改进抗原递送技术和免疫应答调控手段，黏膜疫苗有望成为应对SeCoVs感染的重要工具，为全球养猪业提供更有效的防控方案。