包裹肿瘤团块的血管会降低切除性肝细胞癌患者辅助免疫疗法的效果

《Journal of Advanced Research》：Vessels encapsulating tumor clusters is associated with impaired efficacy of adjuvant immunotherapy in resected hepatocellular carcinoma

肝细胞癌术后高复发风险患者接受Sintilimab联合Lenvatinib治疗可显著延长无病生存期（DFS达59.2个月），尤其在VETC阳性亚组中效果突出，而单用Sintilimab对VETC阳性患者DFS改善有限。机制分析显示VETC阳性肿瘤微环境免疫抑制特征显著，表现为CD8+ T细胞浸润减少、CD4+ T细胞及调节性T细胞增多，联合治疗可有效逆转这一状态。

　　肝细胞癌（HCC）作为一种高度侵袭性的恶性肿瘤，其术后复发率一直较高，严重影响患者的预后。在临床实践中，识别能够有效预测肿瘤复发的病理特征对于制定个体化治疗方案至关重要。近年来，血管特征在HCC的复发预测中扮演了重要角色，其中“肿瘤簇被血管包裹”（VETC）这一模式因其与肿瘤的侵袭性和转移能力密切相关而受到广泛关注。本研究旨在探讨术后使用Sintilimab（AS）或联合Lenvatinib（ASL）与单纯主动监测（AM）相比，在高危HCC患者中的疗效差异，特别关注VETC阳性亚型的治疗反应。此外，通过分子层面的分析，揭示VETC阳性HCC的生物学特性及其对免疫治疗的影响。

### 一、研究背景与意义

HCC是全球范围内发病率和死亡率均较高的癌症之一，其发病率和死亡率每年都在上升。尽管手术切除是目前延长生存期和改善生活质量的主要手段，但高复发率仍是术后治疗面临的重大挑战。研究表明，术后病理特征，如微血管侵犯（MVI）和VETC，对于预测肿瘤复发具有重要意义。VETC是一种独特的血管模式，表现为肿瘤簇被窦状血管包围，这种结构与HCC的侵袭性生物学行为及新型转移机制有关。值得注意的是，VETC在HCC的不同阶段均有广泛分布，其发生率范围为14.2%至56.3%。尽管已有大量流行病学研究和临床数据支持VETC与不良预后之间的关联，但针对VETC阳性HCC的专门研究仍较为有限。

IMbrave 050试验是首个报道Atezolizumab联合Bevacizumab在肝切除或消融后具有疗效的全球性研究。然而，后续更新结果表明，该策略在降低晚期复发方面的作用有限。另一项随机对照试验（RCT）显示，接受Sintilimab辅助治疗的MVI阳性HCC患者具有较好的预后，但其结果的局限性使得Sintilimab对更广泛人群的疗效仍存在不确定性。因此，开展一项多中心研究，比较AM、AS和ASL在高危HCC患者中的生存差异，并对VETC阳性亚型进行专门分析，显得尤为必要。同时，通过RNA测序、数字空间分析（DSP）和多重免疫荧光（mIF）技术，进一步探讨VETC阳性HCC的分子特征。

### 二、研究方法与设计

本研究是一项多中心回顾性研究，纳入了2019年至2023年间接受肝切除术的患者。研究对象的纳入标准包括年龄在18至75岁之间、肿瘤完全切除、组织学确认为HCC、肝功能为Child-Pugh A或B级、无其他严重系统性疾病或器官功能障碍、具有高复发风险（如肿瘤直径≥5cm、多发肿瘤、门静脉癌栓、卫星结节、MVI或分化不良等），以及接受AM、AS或ASL治疗。排除标准包括其他恶性肿瘤病史、HCC复发、肝外转移、既往HCC治疗、术后严重并发症、临床数据不完整、无石蜡包埋组织可供分析，以及接受其他辅助治疗的患者。

为验证研究结果，我们从已发表的RCT中提取了相关临床数据，作为验证队列。同时，对接受新辅助治疗的患者进行了回顾性分析，纳入了2024年至2025年间接受经导管动脉化疗栓塞（TACE）联合PD-1抑制剂和Lenvatinib（TPL队列）或TACE联合PD-1抑制剂（TP队列）的患者。所有患者在手术前接受了1至3个周期的新辅助治疗，其余纳入和排除标准与辅助治疗队列保持一致。

### 三、随访与定义

术后随访每6个月进行一次，之后每2至3个月进行一次。随访期间，我们收集了所有患者的复发信息，包括复发模式和复发后的首选治疗方案。MVI和VETC的定义基于组织切片的免疫组化（IHC）染色。MVI被定义为在显微镜下观察到的肿瘤细胞巢位于内皮细胞衬里的血管腔内。而VETC则表现为类似窦状血管形成的网状结构，包裹肿瘤簇。VETC阳性病例被定义为在肿瘤切片中，无论是否完全或部分呈现该模式，均被归类为VETC阳性。为减少偏倚，所有主观变量（如MVI和VETC状态）均由两位不知晓患者临床信息的资深专家独立评估，若存在分歧，则引入第三位专家进行讨论，直至达成一致。

### 四、结果分析

本研究共纳入620例高危HCC患者，其中248例接受AM治疗，230例接受AS治疗，142例接受ASL治疗。在基线特征方面，三组之间总体相似，但肿瘤破裂情况存在显著差异（p=0.049）。经过倾向评分匹配（PSM）后，每组保留了135例患者，且基线特征趋于平衡。研究的随访截止时间为2025年4月30日，整个队列的中位随访时间为46.9个月（IQR 40.6–52.7），其中AM组的随访时间最长（49.2个月；IQR 46.1–58.0），其次是AS组（44.1个月；IQR 35.2–51.7）和ASL组（43.0个月；IQR 36.1–51.6）。

在未进行PSM前，AS和ASL均显著降低了术后复发风险（p<0.001），并延长了无病生存期（DFS）和总生存期（OS）（p<0.001）。然而，经过PSM后，DFS的差异进一步得到验证。具体而言，AM组的2年DFS率为38.5%，中位DFS为12.2个月；AS组的2年DFS率为51.6%，中位DFS为26.0个月；ASL组的2年DFS率为65.6%，中位DFS为59.2个月（p<0.001）。值得注意的是，ASL组的DFS显著优于AS组（p=0.021）。然而，OS方面，无论是AS还是ASL组，均未显示出显著优势（p=0.126）。在VETC阳性亚组中，AS的DFS和OS优势并不明显（p=0.681和p=0.756），而ASL则显著改善了DFS（p=0.001）和OS（p=0.043）。

此外，我们还分析了新辅助治疗对VETC阳性HCC的影响。共纳入140例接受新辅助治疗的患者，其中TPL组69例，TP组71例。术后手术切除标本的分析显示，未接受治疗的患者VETC阳性率最高（50.3%），而TP组和TPL组的VETC阳性率分别为40.8%和18.8%（p<0.001）。经过PSM后，TPL组的VETC阳性率仍显著低于未治疗组（18.2% vs. 53.0%，p<0.001），而TP组的VETC阳性率降低幅度较小（39.4%），且未达到统计学意义。在复发患者中，接受PD-1抑制剂联合Lenvatinib治疗的患者显示出了更好的治疗反应率（ORR）和PFS，特别是在VETC阳性亚组中，ORR达到56.1%，而单用PD-1抑制剂的ORR仅为33.4%（p<0.001）。

### 五、分子机制分析

为了进一步阐明VETC阳性HCC的生物学特性，我们采用了RNA测序、DSP和mIF技术进行分析。RNA测序结果显示，VETC阳性HCC中存在一系列与肿瘤侵袭性和免疫抑制相关的基因表达差异。例如，FGFR3在VETC阳性HCC中显著高表达，而PD-L1的表达则相对较低。这提示FGFR3可能是Lenvatinib作用的重要靶点，而PD-L1的低表达可能与免疫治疗的有限效果有关。

DSP分析显示，VETC阳性HCC的肿瘤组织中CD8+ T细胞浸润显著减少，而CD4+ T细胞和调节性T细胞（Tregs）则显著增加。这一发现进一步支持了VETC阳性HCC可能通过物理排斥和主动抑制两种机制逃避免疫攻击。在肿瘤微环境中，CD8+ T细胞的减少可能与免疫治疗的疗效受限有关，而Tregs的增加则可能进一步抑制免疫反应。通过mIF分析，我们还发现VETC阳性HCC中Tregs的密度显著升高，这与DFS的缩短相关（HR=1.9，95% CI: 1.11–3.25，p=0.018），但OS方面则未见显著差异（HR=0.81，95% CI: 0.42–1.56，p=0.540）。

此外，我们还利用单细胞RNA测序数据构建了细胞类型特异性特征矩阵，并通过CIBERSORTx算法对批量RNA测序数据进行了去卷积分析，以估计不同细胞类型的相对比例。结果表明，VETC阳性HCC的免疫微环境呈现出明显的抑制特征，包括抗原呈递功能的下调和CD8+ T细胞的减少。这一发现与我们通过IHC和DSP获得的结果一致，进一步揭示了VETC阳性HCC的免疫逃逸机制。

### 六、讨论与临床意义

HCC术后复发率较高，但目前尚无统一的术后辅助治疗共识。本研究发现，尽管AS和ASL均能有效降低复发率，但OS方面未见显著差异。这一现象可能由以下两个原因解释：首先，DFS的延长可能需要更长的随访时间才能转化为OS的显著改善；其次，近年来HCC治疗领域的进展显著提高了整体抗肿瘤疗效和OS水平，这可能减弱了DFS延长带来的生存获益。因此，在评估辅助治疗效果时，需要考虑这些因素。

VETC阳性HCC因其高度侵袭性而备受关注。本研究发现，AS在VETC阳性患者中效果有限，而ASL则表现出显著的生存优势。这可能与VETC阳性HCC的免疫微环境密切相关。我们推测，VETC阳性HCC可能通过两种机制逃避免疫攻击：一是其独特的血管结构物理性地限制了CD8+ T细胞的浸润，导致“免疫排斥”微环境的形成；二是肿瘤可能招募或诱导免疫抑制性的Tregs，从而进一步抑制免疫反应。这些机制可能解释了为什么AS在VETC阳性患者中效果不佳，而ASL则能显著改善预后。

Lenvatinib的加入可能通过干扰VETC维持所需的肿瘤-内皮细胞相互作用，从而打破其免疫逃逸机制。这一假设得到了动物模型实验的支持，其中Angiopoietin-2的基因敲除或Lenvatinib的使用均能有效消除VETC结构。此外，我们还发现，Lenvatinib能够促进T细胞激活，从而引发IFN-γ的分泌和肿瘤细胞上PD-L1的适应性上调，进而动态改变免疫微环境。这些机制可能解释了为何ASL在VETC阳性患者中表现出更好的疗效。

值得注意的是，IMbrave 050试验中，Atezolizumab联合Bevacizumab在术后治疗中的效果有限，这可能与纳入的患者群体中VETC阳性比例较低有关。类似地，在尿路上皮癌的IMvigor010试验中，最初的结果显示免疫治疗无效，但后续分析发现，在循环肿瘤DNA阳性患者中效果显著。这提示，在HCC的辅助治疗中，明确患者的风险分层和选择合适的治疗策略至关重要。

### 七、研究局限性与未来方向

尽管本研究提供了重要的临床证据，但仍存在一些局限性。首先，研究设计为非前瞻性随机对照试验，可能引入潜在的混杂因素。其次，纳入的患者以乙型肝炎相关性HCC为主，其他病因的HCC病例较少，这可能影响研究结果的普遍性。此外，虽然我们推测Lenvatinib通过干扰VETC维持机制来发挥协同作用，但这一因果关系仍需通过更直接的方法进行验证，例如VETC特异性基因敲除模型或先进的活体成像技术。

未来的研究方向包括探索Lenvatinib单药治疗是否足以改善VETC阳性HCC的预后，以及开发针对VETC阳性患者的个体化治疗策略。此外，进一步研究VETC的分子机制，如IGF2的高表达及其在肿瘤发生、生长和转移中的作用，将有助于优化治疗方案。随着对HCC分子机制的深入理解，VETC有望成为指导术后辅助治疗的重要生物标志物。

### 八、结论

本研究验证了VETC阳性HCC与免疫抑制性肿瘤微环境之间的紧密关联，解释了为何Sintilimab单药治疗在这一亚组中效果有限。同时，研究结果表明，Lenvatinib的加入显著改善了VETC阳性患者的DFS和OS。这一发现为VETC阳性HCC的个体化治疗提供了新的思路，即在术后辅助治疗中，结合PD-1抑制剂和Lenvatinib可能是一种更优的选择。未来，随着更多临床试验和分子机制研究的开展，VETC有望成为指导HCC治疗的重要生物标志物。