通过扩散和依赖于细胞骨架的机制，应激诱导蛋白酶体的重组

《Small》：Stress-Induced Reorganization of Proteasomes Through Diffusion and Cytoskeleton-Dependent Mechanisms

本研究通过单分子定位、光片显微术等技术，发现α-突触核蛋白聚集诱导的蛋白酶体重排形成TAADs（瞬时聚集相关滴plet），其过程依赖细胞骨架完整性。纳米滴管注射证实细胞骨架介导的运输是TAADs形成的关键机制。单粒子追踪分析显示应激状态下蛋白酶体扩散受限，形成受限运动或主动运输群体，从而增强聚集清除效率。膜电位变化通过调控细胞骨架依赖的运输影响蛋白酶体定位。研究揭示了蛋白酶体动态定位与细胞应激的关联机制。

　　本研究围绕细胞内蛋白酶体（proteasome）在面对蛋白质毒性压力时的动态行为展开，特别是探讨了蛋白酶体如何重新组织并形成一种特殊的结构——瞬时聚集相关液滴（transient aggregate-associated droplets, TAADs）。蛋白酶体作为细胞内重要的蛋白降解系统，其分布和活动对维持细胞内蛋白质稳态（proteostasis）至关重要。当细胞遭遇蛋白毒性压力时，例如α-突触核蛋白（alpha-synuclein, aS）形成的聚集物进入细胞，蛋白酶体的分布和行为会发生显著变化，以应对这种压力。本文通过多种先进的成像和生物物理技术，系统地分析了蛋白酶体在不同状态下的运动模式和定位变化，揭示了细胞在应激条件下对蛋白酶体的精确调控机制。

在细胞正常状态下，蛋白酶体主要以两种形式存在：20S核心颗粒（CP）和19S调节颗粒（RP）。CP通常负责降解无序或变性的蛋白质，而RP则具有识别和修饰这些蛋白质的能力。蛋白酶体的完整形式是两者的结合产物，即蛋白酶体全酶（holoenzyme），其数量和分布会随着细胞内外的条件变化而调整。研究发现，尽管细胞在应激条件下会发生显著的蛋白酶体再分布，但20S核心颗粒与19S调节颗粒的比例（约60%）基本保持不变。这表明，蛋白酶体的分布变化可能与它们的组装状态和局部浓度有关，而非整体数量的改变。这种现象对于理解细胞如何在应激条件下维持蛋白质稳态具有重要意义。

为了进一步探究TAAD的形成机制，研究者使用了纳米吸管（nanopipette）注射技术，将aS聚集物引入活细胞中。这一方法使得蛋白酶体的重新组织过程能够被更精确地观察和量化。结果表明，TAAD的形成依赖于细胞骨架的完整性，尤其是微管和肌动蛋白网络。这说明，蛋白酶体在细胞内的移动可能受到细胞骨架的引导，从而在特定区域聚集。此外，研究还发现，TAAD的形成与细胞膜电位的变化密切相关。通过单细胞膜片钳技术，研究者发现，当细胞膜电位发生改变时，蛋白酶体的定位也会随之变化，表明膜电位可能在调控蛋白酶体运动中扮演重要角色。例如，超极化（hyperpolarization）会促使蛋白酶体向细胞膜附近聚集，而去极化（depolarization）则会使其向细胞内部迁移。这一发现不仅揭示了蛋白酶体运动与细胞膜电位之间的直接联系，也为理解细胞在应激状态下如何动态调整蛋白酶体的定位提供了新的视角。

研究进一步探讨了蛋白酶体在应激条件下的运动模式。通过单粒子追踪（single-particle tracking, SPT）分析，研究者发现，细胞内存在两种不同类型的蛋白酶体运动：快速扩散（fast diffusion）和慢速扩散（slow diffusion）。在正常状态下，这两种运动模式的比例相对稳定，但在aS聚集物进入细胞后，蛋白酶体的运动逐渐向慢速扩散转移。这种变化意味着，蛋白酶体可能被限制在特定的区域，如TAAD中，以提高对聚集物的降解效率。研究还发现，TAAD的形成不仅依赖于蛋白酶体的聚集，还可能受到细胞骨架的引导，以及细胞膜电位的调控。这一发现支持了TAAD作为一种细胞应激反应机制的假设，即在面对蛋白质毒性压力时，细胞通过调整蛋白酶体的运动模式和定位，形成一种更高效的降解系统。

研究还对比了TAAD与另一种由高渗压力诱导形成的液滴——液-液相分离形成的蛋白酶体聚集（LLPS-foci）。尽管两者都属于蛋白酶体的重新组织形式，但TAAD与LLPS-foci在形成机制和定位上有显著差异。TAAD主要出现在细胞质中，而LLPS-foci则多集中于细胞核。这种差异可能与不同的应激类型有关，例如高渗压力可能促使蛋白酶体在细胞核中形成，而aS聚集物则可能在细胞质中触发TAAD的形成。此外，研究还发现，TAAD的形成与细胞膜电位的变化密切相关，而LLPS-foci的形成则似乎不受细胞骨架的影响。这些发现表明，细胞可能根据不同的应激类型，采用不同的机制来调控蛋白酶体的分布和功能。

在实验方法上，研究采用了多种先进的成像技术，如单分子定位显微镜（single-molecule localization microscopy, SMLM）和光片显微镜（light-sheet microscopy），以精确地追踪蛋白酶体的运动轨迹。这些技术能够提供高分辨率的细胞内蛋白酶体分布信息，使得研究者能够量化其在不同细胞区室中的相对丰度。此外，单细胞膜片钳技术被用于测量细胞膜电位的变化，并分析其对蛋白酶体运动的影响。通过这些方法，研究者能够揭示蛋白酶体在应激条件下的动态行为，以及它们如何与细胞膜电位和细胞骨架相互作用。

值得注意的是，研究还探讨了蛋白酶体在不同应激条件下的功能变化。例如，在aS聚集物诱导的TAAD形成过程中，蛋白酶体的运动模式发生了显著改变，表现出更多的受限扩散行为。这种变化可能有助于提高蛋白酶体对聚集物的识别和降解效率，从而维持细胞的蛋白质稳态。然而，研究也指出，TAAD的形成可能与细胞的应激反应机制相关，而非单纯的蛋白质降解过程。例如，TAAD可能在某些情况下作为细胞防御机制的一部分，帮助隔离或清除毒性蛋白质，从而减少对细胞功能的干扰。

此外，研究还探讨了蛋白酶体在细胞内的相互作用。例如，在正常状态下，蛋白酶体的快速扩散和慢速扩散比例大致保持不变，但在应激条件下，慢速扩散的比例显著增加，而快速扩散的比例则减少。这种变化可能反映了细胞在应激状态下对蛋白酶体的调控策略，即通过减少自由扩散的蛋白酶体数量，提高其在特定区域的浓度，从而增强局部的降解能力。研究还发现，蛋白酶体的运动模式可能受到多种因素的影响，包括细胞骨架、膜电位、以及与其他细胞器的相互作用。例如，蛋白酶体可能在某些情况下与内质网（ER）或其他细胞器发生相互作用，从而影响其运动模式。

研究还涉及了蛋白酶体在不同细胞类型中的行为差异。例如，在神经母细胞瘤细胞（如SH-SY5Y细胞）中，TAAD的形成可能与神经元的特殊生理需求有关。此外，研究还发现，蛋白酶体在应激条件下的运动模式可能与它们的组成形式相关。例如，在aS聚集物诱导的TAAD中，自由的RP可能比自由的CP更活跃，而CP则可能更多地与RP结合，形成全酶。这种差异可能与不同类型的蛋白质聚集物对蛋白酶体的需求有关，例如aS可能需要更多的RP参与其降解过程，而其他类型的聚集物可能依赖不同的机制。

综上所述，本研究通过多种技术手段，揭示了蛋白酶体在细胞面对蛋白毒性压力时的动态变化。这些变化不仅包括蛋白酶体的重新分布，还涉及其运动模式的调整，以及与细胞骨架和膜电位的相互作用。研究结果表明，蛋白酶体的再组织是细胞应对应激的一种高度协调的机制，可能通过形成TAAD等结构，提高对聚集物的降解效率。同时，研究也强调了蛋白酶体在维持细胞稳态中的重要作用，以及其在不同应激条件下的适应性变化。这些发现不仅深化了我们对蛋白酶体功能的理解，也为开发新的策略来应对蛋白质毒性压力提供了理论依据。