对来自动物源性肉类的细菌分离株中的抗菌素耐药基因及敏感性谱进行监测

《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》：Monitoring of Antimicrobial Resistance Genes and Susceptibility Profiles in Bacterial Isolates From Animal-Origin Meat

中国集约化养殖中抗生素使用导致食源性耐药菌高流行及基因传播，帕拉纳州禽畜肉样本检测发现产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）菌株占比大肠杆菌32%、克雷伯氏菌36%、沙门氏菌15.5%，碳青霉烯酶基因携带率1.14%，mcr-1基因检出率2.86%。多重耐药现象显著，大肠杆菌19.7%、克雷伯氏菌62.7%、假单胞菌68.6%、沙门氏菌83.7%存在≥3类抗生素耐药。与欧洲数据对比，氨苄西林耐药率69.1%远超欧洲39.5%，第三代头孢菌素耐药率（大肠杆菌15%、沙门氏菌53.7%）显著高于欧洲。耐药基因检出率：TEM-23.3%、CTX-M-14.4%、SHV-4.9%、mcr-1-2.86%。研究证实巴西作为全球动物蛋白主要出口国，其养殖环节抗生素滥用已导致耐药基因向人类传播的显著风险，亟需强化One Health战略下的耐药监测体系。

　　本研究旨在评估巴西巴拉那州鸡、猪肉和鱼肉样本中分离出的细菌对抗生素的敏感性，并检测其中的耐药基因。研究时间跨度为2017年至2023年，共收集了418个肉样样本，其中包括307个鸡样本、61个猪肉样本和50个鱼样本。此外，从2019年起，还纳入了265个大肠杆菌（*Klebsiella* spp.）和262个假单胞菌（*Pseudomonas* spp.）样本。这些细菌的分离和鉴定遵循了ISO 17604:2015标准，并通过MALDI-TOF质谱技术进行确认。对抗生素敏感性测试采用Kirby-Bauer纸片扩散法，以评估不同抗生素对细菌的抑制效果。同时，通过实时荧光定量PCR（qPCR）技术检测了包括bla_TEM、bla_SHV、bla_CTX-M、bla_KPC、bla_NDM、bla_OXA-48、bla_VIM、bla_SPM以及mcr-1在内的多种耐药基因。研究发现，多重耐药（MDR）在不同细菌中普遍存在，尤其是沙门氏菌（*Salmonella* spp.）和假单胞菌（*Pseudomonas* spp.），其次是大肠杆菌和埃希氏菌（*E. coli*）。扩展谱β-内酰胺酶（ESBL）基因在大肠杆菌和大肠杆菌属细菌中较为常见，而耐药质粒介导的粘菌素耐药（mcr-1）和碳青霉烯酶（bla_KPC）也有所检测。研究还发现，对第三代头孢菌素和氨苄西林的耐药率尤其高，这提示了抗生素滥用对食品安全和公共健康的潜在威胁。

研究的背景源于全球范围内抗生素的过度使用对耐药性（AMR）传播的显著影响。抗生素自20世纪30年代被广泛应用于治疗细菌感染，但在随后的几十年中，其在动物生产中的无节制使用和缺乏新抗生素的研发，成为耐药性不断扩散的关键因素。巴西作为全球最大的动物蛋白生产国之一，其抗生素使用量位居世界前列。特别是在2017年，巴西在兽用抗生素消耗方面排名第二，占全球总量的7.9%。这表明，巴西的动物生产系统中，抗生素的使用量可能远高于欧洲等其他地区，从而加剧了耐药性传播的风险。此外，尽管国际社会在2013年和2014年启动了多项抗生素使用和耐药性监测计划，巴西仍未能在这一领域形成系统性的应对措施。

在研究方法上，样本的采集和处理遵循了巴西国家卫生监督系统的标准流程。鸡、猪肉和鱼肉样本均来自巴拉那州的市镇卫生监督机构，以确保数据的代表性。样本在采集后按照规定的步骤进行包装、运输和接收，并在实验室中进行细菌分离和鉴定。对于沙门氏菌和大肠杆菌，研究重点在于检测mcr-1基因，而随着研究的推进，还增加了对其他耐药基因的检测。研究团队在2018年底扩展了检测范围，增加了对*Pseudomonas* spp.和*Klebsiella* spp.的检测，并且在2019年起才开始分析这些细菌的耐药情况。这说明研究的范围和深度随着时间逐步扩展，以应对不断变化的抗生素耐药性问题。

在细菌分离过程中，研究团队采用了ISO 17604:2015标准，并结合了巴拉那州中央实验室（LACEN/PR）的改良方法。每个肉样样本被放入无菌袋中，然后浸入足够的缓冲蛋白水（buffered peptone water）以覆盖整个样本。密封后通过手动摇晃和按摩确保样本与稀释液充分接触，随后将洗液用于富集培养基和选择性培养基的接种。细菌的鉴定则通过MALDI-TOF质谱技术完成，该技术能够快速、准确地识别细菌种类。

在细菌悬液制备阶段，研究团队将分离的菌株重新激活后，接种到麦康凯琼脂（MacConkey agar）上以获得新鲜、纯化的菌落。通过将1至3个菌落转移至3毫升的无菌0.9%生理盐水中，制备了适合药敏测试和DNA提取的细菌悬液。悬液的浊度被调整至与0.5 McFarland标准相符，以确保药敏测试的准确性。

药敏测试采用了Kirby-Bauer纸片扩散法，以 Mueller-Hinton 琼脂平板为载体。在平板上均匀涂抹细菌悬液后，放置含有不同抗生素的纸片，包括亚胺培南、头孢他啶、头孢西丁、阿莫西林/克拉维酸、头孢吡肟、头孢曲松、环丙沙星、氯霉素、氨苄西林、庆大霉素、四环素、阿奇霉素、复方磺胺甲噁唑/甲氧苄啶和替加环素。平板在35°C下培养18至24小时后，测量抑制区的直径，并依据EUCAST指南进行解读，将菌株分类为敏感、中间或耐药。此外，还对粘菌素进行了最低抑菌浓度（MIC）测试，以评估其在不同菌株中的耐药情况。

在DNA提取方面，研究团队采用了简易提取法，将细菌悬液加热至97°C 5分钟，然后在-80°C下保存，以便后续进行qPCR检测。该方法能够在不使用复杂化学试剂的情况下，快速获得高质量的DNA，适用于后续的基因检测。

在qPCR检测中，研究团队使用了TaqMan Fast Advanced Master Mix，并根据不同的目标基因设计了相应的引物和探针。这些引物和探针的浓度分别为20 μM和10 μM。反应体系为11 μL，使用96孔光学板进行操作，并在QuantStudio 5实时PCR系统上运行。自动阈值设置用于结果解读，同时所有实验均包含正负对照以确保准确性。qPCR的循环条件包括50°C 2分钟的脱污处理、95°C 10分钟的Taq激活、40个循环的95°C 15秒和60°C 1分钟的扩增阶段，以及60°C 1分钟的检测阶段。通过这些步骤，研究团队能够准确检测目标基因的存在，并评估其在不同细菌中的分布情况。

研究结果表明，从2017年至2023年，共检测到418个样本中396个为大肠杆菌阳性，总体分离率为94.74%。其中，鸡样本的阳性率为98.7%，猪肉样本为86.9%，鱼样本为80%。对于沙门氏菌（*Salmonella* spp.），总体分离率为31.1%，鸡样本为36.16%，猪肉样本为21.3%，鱼样本为12%。这些数据揭示了不同动物来源样本中耐药细菌的普遍性，同时也反映出检测方法和样本采集时间对结果的影响。

在耐药基因的检测中，研究团队发现KPC基因在4个大肠杆菌样本中存在，占总样本的1.14%。所有KPC阳性菌株均来自鸡样本，表明鸡源性细菌在耐药基因携带方面具有较高的比例。此外，mcr-1基因在10个大肠杆菌和2个*Klebsiella* spp.样本中被检测到，分别占2.86%和0.91%。这些结果表明，粘菌素耐药性在巴西的动物源性细菌中已经出现，并且可能与抗生素的使用和残留有关。

在ESBL基因的检测中，研究发现*E. coli*中bla_TEM基因的携带率最高，占32%，其次是bla_CTX-M（16.6%）和bla_SHV（4.9%）。对于*Klebsiella* spp.，bla_SHV基因的携带率最高，为36.3%，而bla_TEM和bla_CTX-M的携带率相对较低。在沙门氏菌（*Salmonella* spp.）中，bla_CTX-M的携带率最高，占15.5%。相比之下，假单胞菌（*Pseudomonas* spp.）中ESBL基因的携带率较低，仅为2.3%。这些数据表明，不同细菌对ESBL基因的携带情况存在显著差异，可能与它们的生态位、传播途径和抗生素暴露水平有关。

多重耐药基因的检测结果显示，部分菌株携带了多个耐药基因。在*E. coli*中，约12.3%的菌株携带两个或以上的耐药基因，其中bla_TEM和bla_CTX-M的组合最为常见。在*Klebsiella* spp.中，约10.5%的菌株携带多个耐药基因，主要为bla_TEM、bla_CTX-M和bla_SHV的组合。在沙门氏菌中，多重耐药基因的携带率较低，仅为3.3%。而在假单胞菌中，未检测到多重耐药基因的共存情况。这些数据提示，多重耐药现象在不同细菌中具有不同的发生率，可能与它们的遗传特征和抗生素暴露环境有关。

药敏测试结果显示，不同细菌对抗生素的耐药情况存在显著差异。大肠杆菌中，对第三代头孢菌素（如头孢曲松和头孢他啶）的耐药率分别为12%和8%。对于沙门氏菌，对四环素和氨苄西林的耐药率分别为82.1%和72.4%，这表明这些抗生素在动物生产中的使用可能已被广泛滥用。此外，沙门氏菌对头孢他啶和头孢曲松的耐药率显著高于欧洲的监测数据，这可能与巴西的抗生素使用模式有关。同时，对替加环素的耐药率较低，仅为7.3%，这表明其在某些情况下仍保持一定的有效性。

在比较不同地区和国家的耐药数据时，研究团队发现巴西的耐药情况在某些方面显著高于欧洲。例如，沙门氏菌对四环素的耐药率在巴西为82.1%，而欧洲仅为40.2%。同样，大肠杆菌对头孢他啶的耐药率在巴西为43.8%，而欧洲为33%。这些数据表明，巴西的抗生素使用和耐药性传播问题可能更为严峻。然而，值得注意的是，巴西在某些抗生素（如替加环素）的耐药率较低，这可能与使用规范或监管措施有关。

研究还指出，尽管巴西在近年来加强了对耐药性的监测，如2016年禁止将粘菌素作为生长促进剂，以及建立国家行动计划（PAN-BR和PAN-VISA），但这些措施在实际执行中仍存在不足。研究团队发现，尽管mcr-1基因在鸡样本中早期被检测到，但在猪肉样本中直到2021年才开始出现。这可能与监管执行力度、抗生素使用模式以及细菌传播路径有关。

此外，研究团队还讨论了该研究的局限性。首先，样本采集在不同年份、动物种类和地区之间分布不均，可能导致结果的偏差。其次，研究仅在2019年后纳入*Klebsiella* spp.和*Pseudomonas* spp.，这限制了与早期数据的比较。再次，研究主要依赖零售层面的样本采集，这可能无法完全反映农场或加工环节中的耐药情况。最后，研究未采用分子分型技术（如全基因组测序WGS），这限制了对耐药菌株传播路径和克隆关系的分析。

总体而言，本研究揭示了巴西动物源性食品中广泛存在的耐药性问题，特别是对第三代头孢菌素、四环素和氨苄西林的耐药率较高。这些结果不仅对公共卫生政策制定具有重要意义，也强调了加强动物和人类健康领域的协调监测和管理的必要性。研究建议，应进一步加强农场层面的生物安全措施，规范兽用抗生素的使用，以及提升国家监测计划的覆盖面和精度。只有通过多部门协作，才能有效遏制耐药性在全球范围内的扩散，保护人类和动物健康。