《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Identification of new small molecule inhibitors of PD-1/PD-L1 interaction by a comprehensive ligand fishing system
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PD-1/PD-L1抑制剂从中药中筛选及作用机制研究，采用双目标SPR生物传感器和磁珠法，从黄芩和槐花中分离出baicalin、maackiain、oxysophocarpine三种化合物，证实其通过阻断PD-1/PD-L1结合发挥显著抑制作用，为免疫治疗药物开发提供新资源。
王东瑶|张颖|李丹|夏宁琪|王晓菲|陈晓菲|卢斌|吕迪娅|曹燕
中国上海200433，海军医学院药学院药物分析系
摘要
程序性死亡1（PD-1）检查点/程序性死亡配体1（PD-L1）相互作用抑制剂的开发为癌症治疗开辟了新的途径。越来越多的研究致力于针对这种PD-1/PD-L1相互作用的小分子化合物。在本文中，我们报道了从黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）和黄槐（Sophora flavescens Aiton）草药提取物中发现三种新的PD-1/PD-L1抑制剂，即黄芩素、马基胺和氧索福卡品，这些抑制剂是通过一种综合配体筛选系统发现的，该系统结合了双靶标表面等离子体共振生物传感器和磁珠方法。这三种化合物在体内血清中也得到了验证，通过结合亲和力评估、分子对接和竞争性酶联免疫吸附测定（ELISA）证实它们能够作用于PD-1/PD-L1的结合界面。因此，这些成分可能是潜在的PD-1/PD-L1抑制剂，并可作为免疫治疗药物发现的先导化合物。这些结果还突显了双靶标表面等离子体共振（SPR）和磁珠配体筛选系统在疾病治疗药物筛选中的有效性。
引言
程序性死亡1（PD-1）检查点/程序性死亡配体1（PD-L1）相互作用抑制剂的发展为对抗多种类型的癌症（包括黑色素瘤、肾癌、头颈癌、肺癌、肝细胞癌和卵巢癌）开辟了新的途径[1]、[2]、[3]。迄今为止，已有几种PD-1抑制剂（纳武利尤单抗、派姆博利尤单抗、塞米普利单抗、多斯塔利尤单抗、托利帕利尤单抗、替雷利尤单抗和雷蒂法利尤单抗等）和PD-L1抑制剂（度瓦鲁单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗和科西贝利单抗等）获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准[4]。
目前，所有FDA批准的PD-1/PD-L1抑制剂都是单克隆抗体药物。尽管抗体药物具有相对较高的疗效、特异性和安全性，但由于反应率不可预测、药物递送限制以及耐药机制复杂，临床治疗效果仍不令人满意。与抗体药物相比，小分子抑制剂具有制造成本低、免疫原性低、储存条件要求不高、稳定性高、半衰期合理以及组织及肿瘤渗透性强等优点。然而，它们也存在选择性低和结合亲和力弱等缺点[5]。针对PD-1/PD-L1相互作用的小分子化合物可以提供有吸引力的替代和补充疗法，相关研究也越来越多[6]。
已经报道了一些具有良好阻断活性的小分子，例如来自BMS公司的联苯型衍生物和肽类似物、来自Incyte公司的咪唑吡啶型衍生物[7]、[8]、来自Mee-Hyun Lee团队的PDI-1[9]、来自Christian Bailly团队的苯基吡唑酮衍生物[10]等。这些衍生物基于计算机辅助虚拟筛选或商业化学库，目前处于临床前阶段或I期临床研究阶段。此外，识别和设计具有多样化化学结构及药效学和药代动力学特性的新型小分子抑制剂非常重要。
中药是中国文明的瑰宝，具有多种成分、多个靶点和多种作用途径的特点，具有治疗癌症或其他疾病的潜力[11]、[12]、[13]。在现代药物开发中，天然产物及其衍生物一直是候选药物和先导化合物的重要来源，因为它们结构多样，包括生物碱、有机酸、苯丙素类、香豆素类、木脂素类、醌类、黄酮类、萜类、三萜皂苷、甾体皂苷、强心苷、单宁等[7]、[14]。因此，为了发现针对PD-1/PD-L1相互作用的新小分子抑制剂，中药是一个很好的选择。
在本文中，我们通过一种综合配体筛选系统发现了三种新的PD-1/PD-L1抑制剂——黄芩素和氧索福卡品，该系统结合了双靶标表面等离子体共振（SPR）生物传感器和磁珠方法，能够在微摩尔水平上中断PD-1/PD-L1的相互作用。这些成分可作为免疫治疗药物发现的潜在先导化合物。此外，这种配体筛选系统被证明是识别作用于多种蛋白质相互作用的中国草药中活性化合物的有效方法，为药物发现提供了一种新方法。
材料与试剂
CM5传感器芯片（SKU：Series S）、含有N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、磷酸盐缓冲液（PBS）和乙醇胺（SKU：BR100050）用于表面等离子体共振分析，购自Cytiva公司（美国加利福尼亚州普莱森顿）。磁珠（型号：D601013-0001）购自Sangon Biotech（中国上海）。人PD-1蛋白（型号：10377-H08H）、PD-L1蛋白（型号：10084-H08H）和PD-L1抗体
PD-1/PD-L1 SPR传感器的活性
如何准确筛选中药中的活性成分以确定特定靶点是一个重大挑战[21]。分子识别技术是主要的筛选策略，通常在筛选前将大分子固定在载体上，然后根据大分子与成分之间的相互作用强度来分离和鉴定不同的活性成分。然而，许多因素可能会影响筛选效果，如浓度、孵育时间和洗涤条件等
结论
在本研究中，我们使用基于双靶标表面等离子体共振生物传感器的活性成分识别方法和磁珠筛选方法，发现了三种新的PD-1/PD-L1抑制剂，这些抑制剂能够在微摩尔水平上中断PD-1/PD-L1的相互作用。黄芩素、马基胺和氧索福卡品可能作用于PD-1/PD-L1的结合界面，并在分子水平上表现出显著的抑制效果。因此，这些成分可能是潜在的PD-1/PD-L1抑制剂
作者贡献声明
王东瑶：撰写——原始草稿、研究、概念构思。李丹：撰写——原始草稿、研究、概念构思。张颖：撰写——原始草稿、研究、概念构思。曹燕：撰写——审稿与编辑、资金获取、概念构思。吕迪娅：撰写——审稿与编辑、资金获取、概念构思。王晓菲：研究、数据分析。夏宁琪：研究、数据分析。卢斌：撰写——审稿与编辑
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（82174092资助曹燕，82473892资助吕迪娅）和上海市科学技术委员会（21ZR1483000资助曹燕，22ZR1476900资助吕迪娅）的支持。
