一种经磺酸改性的基于花青素的声光探针，用于选择性检测糖尿病肝损伤中的羟基自由基

《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：A sulfonate-modified cyanine-based photoacoustic probe for selective detection of hydroxyl radicals in diabetic liver injury

水合氢自由基（•OH）在氧化应激相关疾病中起关键作用，但其体内实时检测仍具挑战。本研究开发了一种基于IR780-SO3H的增强亲水性光声探针（OHP），其logP值为-1.051，以改善生物分布。结构表征证实了共轭体系的选择性还原，体外研究表明OHP对•OH具有选择性和线性响应，与其他ROS/RNS干扰小。在糖尿病小鼠中，OHP实现了肝内•OH的动态监测，显示氧化应激水平升高，而二甲双胍治疗可降低•OH水平。体外荧光成像和病理学分析验证了成像结果与疾病严重程度的相关性，且生物安全性评估显示无显著细胞毒性。OHP为氧化应激研究及治疗评估提供了新工具。

　　

董霞帆|张仁伟阳|刘俊连|范璐|向红霞|程中原|王凯

中国无锡江南大学附属儿童医院，214023

摘要

羟基自由基（•OH）在氧化应激相关疾病中起着关键作用，然而在体内实时检测它们仍然具有挑战性。我们通过改进IR780-SO₃H的亲水性（logP = ?1.051）开发了一种对羟基自由基敏感的光声探针（OHP），以提高其生物分布性。结构表征证实了该探针对共轭体系的选择性还原作用，而体外研究表明OHP对•OH具有选择性和线性响应，并且受到其他活性氧（ROS）/RNA的干扰很小。在糖尿病小鼠中，OHP能够动态监测肝脏中的•OH水平，发现氧化应激加剧，而二甲双胍治疗可以缓解这一现象。离体荧光成像和组织病理学验证了成像结果，显示其与疾病严重程度有很强的相关性。生物安全性评估确认该探针在细胞和小鼠中几乎没有细胞毒性。OHP是一种敏感、选择性高且生物相容性好的非侵入性•OH检测工具，为研究氧化应激和治疗效果提供了潜力。

引言

糖尿病（DM）已成为全球性的健康危机，其患病率在全球范围内呈流行趋势[[1], [2], [3], [4], [5]]。这种代谢紊乱的特点是由于胰岛素分泌受损（1型糖尿病）或胰岛素抵抗（2型糖尿病）导致的慢性高血糖[[6], [7], [8], [9], [10]]。糖尿病的长期并发症对多个器官系统构成严重威胁，包括导致失明的视网膜病变、导致肾衰竭的肾病、引起慢性疼痛和肢体截肢的神经病变以及加速的心血管疾病[11]。特别值得关注的是糖尿病性肝病，其中肝脏因持续的代谢紊乱而逐渐受损[12,13]。这些并发症的发病机制与氧化应激密切相关——在这种状态下，活性氧（ROS）的产生超过了细胞的抗氧化防御机制[[14], [15], [16]]。在各种ROS中，羟基自由基（•OH）由于具有极强的反应性和能够无差别地损伤脂质、蛋白质和DNA而特别具有破坏性。在糖尿病条件下，持续的高血糖会触发多种途径，包括多元醇途径、晚期糖基化终产物的形成、蛋白激酶C的激活以及线粒体功能障碍，所有这些都会产生过多的•OH[16]。这种氧化攻击不仅加剧了组织损伤，还通过进一步损害胰岛素信号传导和β细胞功能形成了一个恶性循环，突显了精确监测糖尿病病理生理学中•OH动态的迫切需求。

分子成像技术的最新进展为研究活体系统中的氧化应激提供了强大的工具，其中光声（PA）成像作为一种特别有前景的方法脱颖而出[17]。PA成像独特地结合了光学和超声技术的优点，在深部组织中具有出色的空间分辨率的同时，对分子变化具有较高的敏感性[18,19]。与传统荧光成像不同，后者受到强组织散射和自发荧光的限制，PA成像通过检测光吸收后的热弹性膨胀产生的超声波来工作，从而实现更深的穿透深度（几厘米）并保持高空间分辨率（数十到数百微米）[20]。这项技术对于•OH的检测尤其有价值，因为它允许实时、无创地监测肝脏等深部器官中的氧化应激动态。此外，PA成像能够提供关于分子分布的定量、三维信息，使其非常适合追踪疾病进展和治疗反应[[21], [22], [23]]。因此，开发出能够特异性响应•OH的可激活PA探针可能会彻底改变我们对氧化应激相关病理学的理解，并有助于在临床前和临床环境中评估抗氧化疗法。

在这项研究中，我们介绍了一种对羟基自由基敏感的光声探针（OHP）的合理设计、全面表征和生物学验证，用于在糖尿病条件下特异性检测•OH。该探针通过对花青素染料支架进行战略性结构修饰，以实现最佳的亲水性和靶向特异性。通过详细的光谱分析和系统的体外评估，我们证明了OHP对•OH的卓越选择性，以及对其他生物相关ROS/RNS的低干扰。在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中，OHP成功揭示了与疾病严重程度相关的肝脏•OH产生的空间和时间模式。通过将体内PA成像与体外荧光显微镜和组织病理学检查相结合，我们建立了一种稳健的多模态氧化应激评估方法。此外，我们还展示了OHP在监测二甲双胍治疗中的作用，发现•OH信号显著减弱，这与代谢参数的改善和组织保护相一致。全面的生物安全性评估确认了该探针的极低细胞毒性和优异的生物相容性。这项工作不仅为研究糖尿病中的氧化应激提供了强大的分子工具，还为开发针对其他涉及活性物种的病理过程的可激活PA探针建立了一个通用框架。

材料与方法

所有化学试剂（包括氨基酸）均从Aladdin（中国上海）和Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买。吲哚购自Leyan（编号1018212，中国上海Leyan）。苏木精和伊红（H&E）染色液购自Solarbio（中国北京）。胎牛血清（FBS）来自NEST Biotechnology Co., Ltd.（中国）。所有核磁共振分析均在Bruker DRX-400光谱仪上进行，操作频率为400 MHz。

结果

羟基自由基响应探针（OHP）是通过使用硼氢化钠（NaBH₄）选择性还原磺酸功能化的花青素染料IR780-SO₃H中的双键合成的（图S1）。通过最终产品的¹H NMR和¹³C NMR光谱的比较分析，确认了OHP的结构（图S2-S3）。OHP的¹H NMR光谱中特征性的乙烯基质子信号的消失以及新的脂肪族质子共振的出现，证实了

讨论

为了更好地理解我们OHP探针的重要性，将其与现有的•OH检测方法进行比较是有意义的。传统的检测技术，如荧光成像和电化学传感，极大地促进了我们对氧化应激的理解。荧光探针具有高灵敏度和亚细胞分辨率，但受到可见光穿透深度有限的根本限制，这阻碍了它们在深部组织成像中的应用。

结论

总之，我们成功开发了一种基于磺酸修饰的花青素光声探针OHP，用于选择性检测羟基自由基。该探针对•OH表现出卓越的选择性，在反应后PA信号显著增强，并且受到竞争物种的干扰很小（<5%的信号变化）。它对•OH浓度在0到50 μM范围内的响应高度线性（R² = 0.99329），从而实现了定量评估。

CRediT作者贡献声明

董霞帆：撰写——初稿、验证、监督、资源提供。张仁伟阳：资金获取、正式分析、数据管理、概念构思。刘俊连：项目管理、方法学设计、研究实施、资金获取。范璐：监督、软件开发。向红霞：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、数据可视化。程中原：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、数据可视化。王凯：撰写——审阅与编辑，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了广州市科学技术项目（2024A04J4341）和中央高校基本科研业务费（21624219）的支持。作者感谢Scientific Compass公司的周媛女士（www.shiyanjia.com）在共聚焦分析方面提供的宝贵帮助。