《Journal of Proteomics》：Lunatin-1: A peptide derived from the venom of the
Hadruroides lunatus scorpion modulates signaling pathways in HL60 tumor cells to induce cytotoxic effects
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Lunatin-1通过抑制MAPK和PI3K/AKT信号通路诱导HL-60白血病细胞凋亡，机制涉及caspase依赖和非依赖途径，为白血病治疗提供新候选。
埃德莱乌萨·M·利马-巴蒂斯塔（Edleusa M. Lima-Batista）、迪亚娜·保拉·戈麦斯-门多萨（Diana Paola Gómez-Mendoza）、毛里西奥·诺盖拉·莫伊塞斯（Maurício Nogueira Moysés）、卡米拉·德索萨·戈麦斯（Kamila de Sousa Gomes）、布雷纳·库尼亚·卡瓦略（Brener Cunha Carvalho）、玛丽亚·埃莱娜·德利马（Maria Elena de Lima）、埃莱恩·M·索萨-法贡德斯（Elaine M. Souza-Fagundes）、阿里斯托博洛·门德斯·达席尔瓦（Aristóbolo Mendes da Silva）、弗兰克·凯尔森（Frank Kjeldsen）、蒂亚戈·维拉诺-布拉加（Thiago Verano-Braga）、阿德里亚诺·M·C·皮门塔（Adriano M.C. Pimenta）
巴西米纳斯吉拉斯联邦大学生物科学研究所生物化学与免疫学系，邮编31270-901，贝洛奥里藏特，米纳斯吉拉斯州
摘要
Lunatin-1是一种由Hadruroides lunatus蝎子毒液提取的13个氨基酸组成的细胞毒性肽。本研究利用整合蛋白质组学和磷酸蛋白质组学技术，探讨了其对人类前髓系白血病细胞系HL-60的早期信号传导影响。Lunatin-1调控了凋亡的关键介质（如caspase-2和MEK1），并影响了MAPK和PI3K/AKT等主要信号通路。它既能通过依赖caspase的途径也能通过非依赖caspase的途径诱导细胞凋亡，同时降低AKT1的磷酸化水平并促进BAX的活化，这些现象与线粒体凋亡机制一致。这些发现表明Lunatin-1能够破坏促进细胞存活的信号通路，并激活多种细胞死亡途径，因此有望成为治疗血液系统恶性肿瘤的候选药物。
意义
本研究全面分析了Lunatin-1在HL60白血病细胞中引发的早期分子变化。通过整合蛋白质组学和磷酸蛋白质组学方法，我们发现Lunatin-1破坏了MAPK和PI3K/AKT等关键生存通路，并激活了依赖caspase和非依赖caspase的凋亡机制。该肽还调节了参与DNA损伤响应、细胞周期调控和氧化应激的蛋白质，揭示了其多方面的细胞毒性作用。这些发现有助于我们进一步理解基于毒液的肽类化合物作为抗癌剂的潜力，同时也凸显了Lunatin-1在治疗耐药癌细胞群体中的治疗前景。
引言
癌症是最严重的公共卫生问题之一，占全球非传染性疾病相关死亡人数的约20%[1]。白血病表现为骨髓中细胞异常增生。2022年全球报告的新发病例数为486,777例，死亡人数为305,033人[1,2]。急性髓系白血病（AML）是一种以造血系统快速分裂的克隆细胞积聚为特征的白血病类型。这些异常细胞可能分化不良或部分分化，会浸润骨髓、血液系统，甚至其他组织，最终导致外周血液循环中健康血细胞减少[3]。AML中的恶性细胞增殖通常由异常的细胞内信号传导驱动。PI3K/AKT/mTOR信号通路是AML中常受影响的通路之一，该通路常处于激活状态，在促进癌症进展中起关键作用[4]。
AML的传统治疗方法主要分为三种：第一种针对年轻患者，采用高剂量阿糖胞苷和核苷类似物联合靶向抑制剂（如FLT3酪氨酸激酶抑制剂和异柠檬酸脱氢酶抑制剂）的强化化疗；第二种适用于年龄较大或身体状况较差的患者，采用低强度化疗方案（如亚甲基化药物）；第三种则是新型靶向疗法，旨在克服耐药突变，例如调节TP53活性的APR246以及增强巨噬细胞吞噬功能的抗CD47抗体magrolimab[5]。近年来，CAR-T细胞疗法也成为AML治疗的新方法，主要针对白血病母细胞高表达的抗原，如C型凝集素样分子-1（CLL-1）、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素3（CD33）、白细胞介素-3受体α链（CD123/IL-3Rα）和CD135/FLT3[6, 7, 8]。
此外，许多研究者关注基于毒液的化合物在癌症治疗中的潜在应用。这类化合物因其低分子量、高稳定性、良好的细胞穿透能力和选择性细胞毒性而备受青睐，非常适合开发减少传统化疗副作用的靶向治疗策略[9, 10, 11]。
Lunatin-1是一种由13个氨基酸组成的肽（H-FIGGLLKTLTSFF-NH2），单体质量为1441.83 Da，存在于秘鲁Hadruroides lunatus蝎子的毒液中。最新研究表明，Lunatin-1对乳腺癌细胞系MDA-MB-231（ATCC HTB-26和MCF-7（ATCC HTB-22）以及肝癌细胞系HepG2（ATCC HB-8065）具有细胞毒性；同时，它也对非肿瘤细胞系HEK-293（ATCC CRL-1573）具有毒性。在MDA-MB-231中，Lunatin-1通过破坏细胞膜完整性发挥细胞毒性作用[12]。
本研究旨在探讨Lunatin-1对HL60细胞的细胞毒性效应。研究发现，Lunatin-1破坏了MAPK和PI3K/AKT等关键生存通路，这两种通路在癌症中常常失调，对细胞增殖、代谢和抗凋亡能力至关重要。通过整合蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析，我们揭示了Lunatin-1引发的早期分子变化，明确了其细胞毒性作用的靶点和相关通路，进一步阐明了其作为血液系统恶性肿瘤治疗候选药物的潜力。
细胞培养与Lunatin-1处理
HL-60细胞在37°C和5% CO2条件下，使用含有10%（v/v）热灭活胎牛血清（FBS）、1%（v/v）抗生素溶液（100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）以及2 mM L-谷氨酰胺（均来自Sigma-Aldrich）的RPMI培养基中进行培养。细胞以每孔1.5×106个细胞的密度接种在6孔板中，并用50 μM的Lunatin-1处理30或60分钟。未处理的细胞作为对照（0分钟）。培养后...
经Lunatin-1处理的HL60细胞的蛋白质组和磷酸蛋白质组分析
蛋白质组学分析（图1A）共鉴定出HL60细胞中的3555种蛋白质，并在各个处理时间点量化了2094种蛋白质。使用单因素方差分析（p<0.05）和1.3的倍数变化阈值（表示由于处理导致的蛋白质丰度变化至少为30%）筛选出受Lunatin-1显著调控的蛋白质和磷酸肽。共有601种蛋白质受到调控，其中30分钟和60分钟处理后分别有239种和365种蛋白质发生变化。
讨论
本研究通过蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析评估了Lunatin-1对HL60肿瘤细胞信号通路的影响。细胞增殖与死亡之间的平衡对发育、免疫功能和组织稳态至关重要，受生长和存活因子以及凋亡信号的严格调控。凋亡是一种由多种细胞内和细胞外刺激引发的程序性细胞死亡机制，涉及caspase的激活...
结论
研究表明，Lunatin-1通过同时抑制MAPK和PI3K/AKT信号通路并促进BAX的活化，诱导肿瘤细胞凋亡。鉴于其广泛的细胞毒性作用（包括对非肿瘤细胞的影响），Lunatin-1可能更适合作为辅助疗法，与靶向抗癌药物联合使用以增强治疗效果。
作者贡献声明
埃德莱乌萨·M·利马-巴蒂斯塔（Edleusa M. Lima-Batista）：撰写初稿、方法学设计、实验实施、数据分析。迪亚娜·保拉·戈麦斯-门多萨（Diana Paola Gómez-Mendoza）：撰写、审稿与编辑、撰写初稿、方法学设计、实验实施、数据分析、概念构思。毛里西奥·诺盖拉·莫伊塞斯（Maurício Nogueira Moysés）：方法学设计、实验实施、数据分析。卡米拉·德索萨·戈麦斯（Kamila de Sousa Gomes）：方法学设计、实验实施、数据分析。布雷纳·库尼亚·卡瓦略（Brener Cunha Carvalho）：实验实施、数据分析。玛丽亚·埃莱娜·德利马（Maria Elena de Lima）：撰写、审稿与编辑、资金申请
利益冲突声明
无。
致谢
作者感谢Andrea Maria Lorentzen（南丹麦大学）提供的技术支持。TVB项目获得了CNPq（403725/2024-0；444243/2024-0；406936/2023-4；309965/2022-5）、CAPES-Finance（代码001，88881.700905/2022-01；88887.916694/2023-00）以及FAPEMIG（BPD-00133-22）的资助。MEdeL项目获得了CNPq（310638-2023-2）和FAPEMIG（APQ 00754-24；RED-00185-23）的资助。
