RBM15 RNA结合蛋白的生物信息学和实验特征分析

《Journal of Structural Biology》：Bioinformatic and experimental characterization of the RBM15 RNA binding protein

RNA结合蛋白RBM15通过三个N端RNA识别结构域（RRMs）协同作用，与茎环结构RNA特异性结合，其中RRM2和RRM3形成异源二聚体包裹RNA分子，介导纳米摩尔级结合亲和力，为调控X染色体失活和造血平衡提供结构机制。

　　

Emma Bose|Caleb Mayes|Lance Ellis|Corrine Baker|Sofia Tambalotti|Bryan Eusse|Shengwei Xiong|Yaa Pokua Osei Sarpong|Marwan Shalaby|Lucas Barry|Frank Lewis|Johnson Joseph|Talaidh Isaacs|Derik McCarthy|Dana Katz|Jingyang Wang|Victoria Zirimu|Luis Vargas|Julian Von Hofe|Glen C Aguilar|Alisha N. Jonesa

美国纽约州纽约市纽约大学化学系

摘要

RNA结合基序15蛋白（RBM15）既能结合RNA也能结合蛋白质，从而调节细胞中的多种生理过程，包括在RNA上添加N6甲基腺苷标记、沉默非活跃X染色体上的基因，甚至参与造血作用。尽管其C端的SPOC结构域已被发现能促进蛋白质间的相互作用，但其三个N端RNA识别基序（RRMs）与RNA相互作用的具体结构机制仍需阐明。在这项众包研究中，我们利用公开可用的全基因组RNA二维结构探测数据以及RNA结合蛋白（RBP）交联和免疫沉淀（CLIP）数据，来识别与RBM15结合的RNA。结合实验表明，RRMs协同作用，以纳摩尔级的亲和力结合具有茎环结构的RNA基序。结构建模和核磁共振（NMR）光谱分析显示，RRMs 2和3呈同轴堆叠形成异二聚体，围绕结构化的RNA形成一个类似三明治的构型。总体而言，这项研究为RBM15通过与RNA的相互作用来调控生物功能提供了结构上的见解。

引言

RNA结合基序15（RBM15）蛋白，也称为OTT1，属于SPEN蛋白家族（Ma, 2001; Ariyoshi和Schwabe, 2003）。它具有三个N端RNA识别基序（RRMs）以及一个SPOC结构域。RBM15调控多种细胞过程，包括RNA剪接、核输出、造血细胞稳态和染色体失活（Zhang, 2019; Lindtner, 2006; Raffel, 2007; Patil, 2016; ?led?和Jinek, 2016; Su, 2022）。该蛋白最著名的功能是作为Wilms'肿瘤1相关蛋白（WTAP）/甲基转移酶类似物3（METTL3）/甲基转移酶类似物14（METTL14）（WMM）复合体的辅助蛋白（Zhang, 2019; Lindtner, 2006; Raffel, 2007; Patil, 2016; ?led?和Jinek, 2016; Su, 2022）。WMM复合体负责在DRACH基序内的腺苷上进行N6甲基化（m6A）修饰（其中D = G/A/U, R = G/A, H = A/C/U），这一修饰对RNA稳定性、剪接和基因表达至关重要（Patil, 2016; Zhang, 2015; Park, 2024; Jiang, 2021; Huang, 2021）。RBM15及其同源蛋白RBM15B通过将甲基转移酶复合体定位到待修饰的腺苷附近来促进这一过程；RBM15的SPOC结构域与WTAP和METTL3结合，而RRMs则与RNA底物相互作用（Patil, 2016; Yan, 2022; Appel, 2023）。

已发现多种RNA与RBM15相互作用，其中包括两种特征明确的长非编码RNA（lncRNAs）：X染色体非活跃特异性转录本（XIST）和功能性基因间重复RNA元件（FIRRE）（Patil, 2016; Brockdorff, 1992; Wutz等, 2002; McHugh, 2015; Pintacuda等, 2017; Jones和Sattler, 2019; Hacisuleyman等, 2016; Hacisuleyman, 2014; Lewandowski, 2019; Yang, 2015; Lu, 2017; Chu, 2015）。XIST能与近80种RNA结合蛋白（RBP）结合，在雌性胎盘哺乳动物中转录沉默非活跃的X染色体（Chu, 2015）。沉默作用由位于XIST转录本5′端的A重复序列域介导；该区域被RBM15结合以调控沉默过程（Patil, 2016; Moindrot, 2015）。FIRRE在哺乳动物物种中高度保守，调控多种生理过程，包括脂肪生成、先天免疫和造血（Hacisuleyman, 2014; Lewandowski, 2019; Yang, 2015）。它由称为局部重复序列（LRs）的可移动元件组成，能与近70种RNA结合蛋白（包括RBM15）相互作用（Graindorge, 2019）。

虽然RBM15在细胞中的作用已经明确，但其与RNA结合的具体结构机制仍不清楚。由于缺乏这方面的信息，我们难以理解RBM15-RNA相互作用的结构-功能关系，并在必要时对其进行治疗性干预。在此研究中，我们结合生物信息学分析和实验方法来探讨RBM15与RNA结合的结构机制。以lncRNAs作为模型系统，我们发现：i) RBM15结合具有茎环结构的RNA基序；ii) RBM15的RRMs 2和3形成异二聚体，从而驱动其与RNA的相互作用。

节选内容

lncRNAs的二维结构预测

我们使用LNCipedia汇编了目前已知的全部X染色体lncRNAs列表。从RASP数据库下载了全基因组化学探测数据集（Li等, 2021; Volders, 2019）。我们开发了一个内部脚本，用于识别RASP数据库中具有化学探测数据的lncRNAs，该脚本的链接为：https://github.com/gpwolfe/match_lncRNA_chromosome。

Ensemble项目（版本109）用于识别每个物种的Homo sapiens典型转录本

RNA的体外转录和纯化

使用自主研发的T7聚合酶对XIST A重复序列和FIRRE RRD中的茎环RNA进行了体外转录。首先，将等摩尔的单链DNA模板（带有T7启动子）和相应的T7启动子寡核苷酸通过快速冷却（95°C后冰浴十分钟）进行退火处理。然后将1 μM的DNA模板与50 μL转录反应液混合，反应液中包含20 μM MgCl?、8 μM的每种核苷三磷酸（rNTP）和5%的聚乙二醇8000

RBM15结合具有茎环结构的RNA基序

我们利用RNA Atlas of Structure Probing（RASP）中的化学探测数据（包括引物延伸（SHAPE）和二甲硫酸（DMS）突变分析（MaP），折叠了多个已被证明在交联和免疫沉淀（CLIP）实验中与RBM15结合的lncRNAs的结构（表S1, S2）（Patil, 2016; Li等, 2021; Van Nostrand, 2020）。这些lncRNAs包括X染色体非活跃特异性转录本A重复序列（XIST）

讨论

尽管已经进行了多项全基因组交联研究来鉴定蛋白质与RNA的结合位点，但关于这些相互作用发生的分子机制仍知之甚少。在本研究中，我们利用RASP数据库中的化学探测数据分析了多个lncRNAs的结构，并通过ENCODE和POSTAR3数据库的CLIP数据确定了RBM15的结合位点。随后通过计算和实验方法验证了这些发现

资助和附加信息

本项工作得到了美国国家科学基金会（National Science Foundation）的资助，金额为2,243,667美元，资助对象为A.N.J.

未引用的参考文献

Sun (2013)

CRediT作者贡献声明

Emma Bose：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，数据分析，概念化。Caleb Mayes：撰写 – 审稿与编辑，数据分析，概念化。Lance Ellis：撰写 – 审稿与编辑，数据分析，概念化。Corrine Baker：撰写 – 审稿与编辑，数据分析，概念化。Sofia Tambalotti：撰写 – 审稿与编辑，数据分析，概念化。Bryan Eusse：撰写 –

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢Jones实验室的成员提供的有益讨论，以及Sattler实验室提供的RBM15质粒。

作者贡献

EB、CM、SX、YPOS、MS、LB、FL、JJ、TI、DM、DK、JW、VZ、LV、JVH、GA、KB、LZ和ANJ负责数据挖掘、RNA结构折叠和生物信息学分析。ANJ、EB、LE、CB、BE和ST负责样品制备及相互作用实验和数据分析。GW编写了数据分析脚本。EB和ANJ撰写了手稿，EB、BE、SX和ANJ进行了修订