线粒体蛋白TOMM7通过调节磷脂酶PLA2G6在细胞内的重新分布来促进自噬过程，从而缓解糖尿病肾病

《Kidney International》：Mitochondrial protein TOMM7 alleviates diabetic kidney disease by regulating mitophagy via intracellular redistribution of phospholipase PLA2G6

本研究揭示TOMM7通过调控PLA2G6亚细胞分布及抑制ZBTB12转录促进肾近曲小管细胞mitophagy，从而减轻糖尿病肾病（DKD）肾损伤。利用db/db小鼠和体外高糖/棕榈酸模型，发现DKD患者及动物模型中TOMM7表达下调，导致线粒体自噬缺陷，并通过开发靶向ZBTB12的利胆酸修饰siRNA成功实现肾特异性TOMM7过表达，显著改善肾功能及mitophagy。

　　

王一辉|常东源|赵一阳|唐思齐伟|赵明辉|陈敏

北京大学第一医院内科肾脏科，北京大学肾脏病研究所，中国卫生部肾脏疾病重点实验室，教育部慢性肾病防治重点实验室，北京100034

摘要

引言

越来越多的证据表明，肾小管损伤在糖尿病肾病（DKD）的发病机制中起着核心作用。线粒体自噬在维持线粒体稳态方面起着关键作用，尤其是在富含线粒体的肾小管细胞中。然而，调控DKD中线粒体自噬的分子机制仍不明确。本研究探讨了外膜转运蛋白7（TOMM7）在DKD进展中的作用，TOMM7是蛋白激酶/泛素连接酶PINK1/Parkin介导的线粒体自噬的关键调节因子。

方法

我们使用DKD患者的肾组织、db/db小鼠以及高葡萄糖/棕榈酸处理的HK-2细胞来研究TOMM7的表达和线粒体自噬活性。进一步探讨了涉及磷脂酶PLA2G6重新分布和锌指蛋白ZBTB12介导的转录抑制的调控机制，并开发了一种与胆汁酸结合的Zbtb12小干扰（si）RNA用于靶向肾脏治疗。

结果

DKD患者、db/db小鼠以及高葡萄糖/棕榈酸处理的肾小管细胞中的TOMM7表达显著下调，同时伴有PINK1/Parkin介导的线粒体自噬受损。db/db小鼠中Tomm7的过表达显著减轻了损伤并恢复了PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。机制上，TOMM7通过调节PLA2G6在细胞核和线粒体之间的重新分布来调控PINK1/Parkin的招募。此外，我们确定ZBTB12是TOMM7的转录抑制因子，并开发了一种针对肾小管细胞的Zbtb12 siRNA以特异性上调TOMM7表达。进一步地，使用胆汁酸结合的Zbtb12 siRNA处理可减轻db/db小鼠的肾小管损伤并增强线粒体自噬。

结论

我们的研究发现，TOMM7通过调节DKD模型中肾小管细胞内PLA2G6的重新分布来增强PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。Zbtb12 siRNA可能是针对DKD中肾小管细胞的潜在治疗策略。

引言

糖尿病肾病（DKD）是糖尿病（DM）最严重的并发症之一，也是全球终末期肾病（ESKD）的主要原因1, 2, 3。在DKD的发展过程中，肾小管损伤的关键作用受到了越来越多的关注4, 5, 6。鉴于肾近端小管细胞（RPTCs）的高能量需求以及线粒体在ATP生成中的重要作用，线粒体稳态的紊乱在DKD的发病机制中起着核心作用7, 8, 9。然而，DKD中线粒体失调的机制尚未完全阐明。因此，揭示其精确机制对于改善DKD的治疗具有重要意义。

线粒体受到复杂的调控机制的调控，这些机制维持其数量、形态和功能的完整性——统称为线粒体质量控制（MQC），包括线粒体生物发生、动态（分裂和融合）以及线粒体自噬10。线粒体自噬是一种选择性自噬过程，可清除受损的线粒体11，在MQC中起着核心作用，因为它与其他MQC途径密切相关12。由于肾脏，尤其是RPTCs的高代谢状态，线粒体稳态和肾功能密切相关13。重要的是，越来越多的证据表明，线粒体自噬的紊乱导致线粒体片段的积累、线粒体活性氧（ROS）的过度产生以及线粒体依赖性凋亡，对DKD的发病机制有重要影响。

PTEN诱导的激酶1（PINK1）和E3泛素蛋白连接酶Parkin介导了最重要的线粒体自噬途径之一。PINK1被导入受损线粒体的外膜（OMM）后激活，随后招募细胞质中的Parkin到线粒体中，促进受损线粒体的自噬清除14。先前的研究确定外膜转运蛋白（TOMM）亚基7（TOMM7）是PINK1在OMM上稳定所需的关键因素15, 16, 17, 18，激活时PINK1的N螺旋与TOMM7在结构上对齐19。因此，研究TOMM7在DKD中的功能作用和干预潜力具有意义。

在本研究中，我们发现TOMM7是DKD发病机制中的关键调节因子，证明了其在减轻肾损伤和增强PINK1/Parkin介导的线粒体自噬中的作用。机制上，TOMM7通过调节PLA2G6在细胞核和线粒体之间的重新分布来促进糖尿病背景下RPTCs中的线粒体自噬。此外，我们开发了一种新型治疗策略，使用与胆汁酸结合的含锌指和BTB结构域的12（Zbtb12）小干扰RNA（siRNA），该siRNA特异性靶向肾小管细胞以上调Tomm7，从而增强线粒体自噬并减轻db/db小鼠的肾损伤。这些发现不仅阐明了DKD中线粒体功能障碍的新机制，还突出了靶向TOMM7及其调控途径的治疗潜力。

动物实验

从Gempharmatech有限公司（南京）购买了C57BLKS/J背景的野生型（WT）和db/db小鼠（雄性），并让它们适应环境一周。为了实现Tomm7的全局过表达，使用了GV388载体进行腺相关病毒（AAV）转染。本动物实验中使用的AAV血清型为AAV9，与其他血清型相比，它在肾脏中的转染效率更高20。七周大的小鼠被随机分为三组：

Tomm7过表达减轻了db/db小鼠的肾损伤并增强了线粒体自噬

我们采用两种不同的过表达策略在小鼠中进行实验：一种是通过Tomm7-ksp-AAV在肾小管上皮细胞中特异性过表达Tomm7，另一种是通过Tomm7-AAV实现Tomm7的全局过表达。

在肾小管上皮细胞中成功实现了过表达（图S1a）。在db/db小鼠中，Tomm7-ksp-AAV处理显著降低了24小时尿白蛋白排泄量、尿白蛋白与肌酐比值（uACR）、尿NGAL和血清甘油三酯水平

讨论

本研究表明TOMM7是DKD发病机制中的重要调节因子。DKD患者和db/db小鼠的肾小管间质中TOMM7表达下调。TOMM7的过表达减轻了db/db小鼠的肾损伤，减少了蛋白尿和肾小管间质损伤，并增强了线粒体自噬。机制上，在糖尿病中，TOMM7表达下降会通过干扰PLA2G6在细胞内的重新分布而损害RPTCs的线粒体自噬。此外，我们还发现胆汁酸

披露声明

质谱蛋白质组学数据已存入ProteomeXchange联盟（https://proteomecentral.proteomexchange.org），数据集标识符为PXD069925。

11. 数据共享声明

质谱蛋白质组学数据已存入ProteomeXchange联盟（https://proteomecentral.proteomexchange.org），数据集标识符为PXD069925。

10. 致谢

我们感谢北京大学第一医院实验动物中心为本研究提供的技术支持。

资助

本研究得到了国家重点研发计划[项目编号2022YFC2502500/2022YFC2502502]、国家自然科学基金[项目编号82470743、82461160318和82090021]以及北京大学第一医院跨部门研究项目[项目编号2024IR05]的资助。