设计一个包含200个单核苷酸多态性（SNP）的基因组芯片，用于个体识别以及利用分离细胞评估基因分型技术的性能

《Legal Medicine》：Design of a 200-SNP panel for individual identification and evaluation of genotyping performance using isolated cells

NGS法200-SNP基因分型系统在低DNA量及抑制物条件下的高灵敏度和准确性验证，通过优化SNP选择和扩增条件实现0.85-0.95等位基因覆盖率比，并验证了在15pg DNA、含腐殖酸及微操作细胞（3细胞）下的高一致性。

　　

南部亮 | 浅利雅治 | 高桥雄太 | 星名千里子 | 森香奈 | 冈田胜弘 | 清水敬子

日本旭川市旭川医科大学法医学系

摘要

我们开发了一种基于下一代测序技术的新型基因分型试剂盒，可用于检测200个单核苷酸多态性（SNP）位点，并评估了该试剂盒在使用少量DNA时的分型性能。我们分析了1144个已知的常染色体SNP，根据等位基因覆盖率（ACR）和扩增子大小筛选出200个具有信息量的SNP，以减少位点间的覆盖不平衡。使用66名日本个体的1 ng DNA对这200个SNP进行了分析。大多数SNP位点的平均ACR在0.85到0.95之间。我们还使用稀释后的DNA样本（500、250、125、60、30和15 pg/反应）检测了SNP基因型，发现即使使用少于100 pg的DNA，也能获得较高的ACR和一致性：当使用60 pg和30 pg的DNA时，一致性分别高达95.7%和88.0%。在初始扩增反应中加入腐殖酸后，我们的方法表现出比其他方法更强的抑制耐受性。当存在10 ng/μL的腐殖酸时，无法检测到SNP谱型；但在加入牛血清白蛋白后，能够获得一致性超过99%的SNP谱型。此外，我们还使用微镊子分离出的少量细胞（10、5、4、3和2个细胞/反应）评估了分型性能，发现三个细胞的分型一致性高达96.1%。这种分离细胞的方法能够准确测定灵敏度，表明我们的方法具有很高的灵敏度，可以为个体识别提供有价值的SNP信息。

引言

下一代测序（NGS）技术的进步使得能够在一次测序过程中对多个法医相关标记和多个样本进行基因分型[1,2]。已经设计了一系列用于身份鉴定、祖先分析、表型分析或亲缘关系分析的法医信息SNP试剂盒[[3], [4], [5], [6]]，并且有多项研究将这些标记组合使用。基于NGS的方法可以作为现有短串联重复序列（STR）分型方法（如毛细管电泳）的补充或替代方案。在SNP分型中，分析的位点数量因目的而异[1]：二级和三级亲缘关系分析分别需要大约472个和2045个SNP[4,7]。相比之下，含有身份识别信息的多重系统可以使用商业试剂盒进行检测[8,9]；例如，ForenSeq DNA Signature Prep Kit（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥，现由Verogen公司销售）可以在一次测试中提供约200个遗传标记。近年来，也出现了包含100到300个SNP的定制试剂盒[10,11]。

可以使用多家制造商提供的网络工具轻松设计针对更多目标位点的引物。然而，设计的试剂盒通常包含一定范围内的扩增子大小（不超过规定的最大尺寸）。引物设计和扩增子的变异性会影响NGS分析初期的扩增效率，从而导致位点间和位点内的等位基因不平衡。NGS分析的整体性能可以通过覆盖深度（DOC）和等位基因覆盖率（ACR）来评估。DOC是指位点内所有有效读数的总和；ACR（也称为杂合子平衡或位点内平衡）是通过较低等位基因覆盖率与较高等位基因覆盖率的比值来衡量的。较低的ACR往往伴随着DOC的下降，而在使用少量DNA进行分析时，这种不平衡会更加明显[12]。然而，很少有研究使用50 pg或更少DNA的定制SNP试剂盒。在低拷贝DNA的稀释系列中观察到PCR随机偏差[13]，因此很难评估基于NGS的SNP分型的实用性。

为了开发适用于可能存在等位基因或位点丢失的法医样本的新型NGS系统，设计一个能够最小化位点间和位点内等位基因不平衡的定制SNP试剂盒非常重要。此外，去除较大尺寸的扩增子也有助于提高扩增效率。另一个需要考虑的因素是NGS分析的初始扩增条件由目标区域的数量决定。例如，在Illumina iSeq 100平台上，对于1000个或更多目标区域，扩增循环次数为15次或更少；而对于193–384个目标区域，则需要17次扩增循环。为了从法医样本中灵敏地检测到SNP，需要选择具有较小扩增子数量的合适位点。先前有研究报道了通过微操作技术从细胞中分离出的DNA进行STR分型[14]，这种策略利用少量细胞能够准确评估基于NGS的SNP分型的灵敏度。

在本研究中，我们开发了一种基于NGS的200-SNP基因分型试剂盒，并评估了其在使用少量DNA时的分型性能。我们分析了1144个已知的常染色体SNP[7]，并根据等位基因平衡和扩增子大小筛选出200个具有信息量的SNP。使用66名日本个体的1 ng DNA对这200个SNP进行了分析。此外，我们还使用66个样本中的3个样本，评估了在稀释DNA样本（500、250、125、60、30和15 pg/反应）以及添加或不添加牛血清白蛋白（BSA）的情况下的SNP基因型。同时，我们还使用微镊子分离出的不同数量的细胞（10、5、4、3和2个细胞/反应）进行了SNP分型，并根据一致性、等位基因丢失（ADO）、等位基因出现（ADI）和位点丢失（LDO）率来评估分型性能。

实验部分

66名无关健康个体的DNA样本

从66名健康的、无关的日本个体中收集了口腔细胞。使用Qiagen公司的QIAmp DNA Mini Kit（德国希尔登）提取DNA。按照制造商的说明，使用Applied Biosystems公司的Quantifiler Human DNA Quantification Kit（美国加利福尼亚州福斯特城）确定了DNA的数量。本研究获得了XXX大学伦理委员会的批准（为盲审目的进行了匿名处理），并且所有样本提供者都签署了书面知情同意书。

200-SNP标记的选择

200-SNP基因分型试剂盒的性能

我们使用多重引物对500或100 pg的DNA中的1144个SNP进行SNP分型，以筛选出在少量DNA下仍具有信息量的200个SNP。200个SNP位点的扩增子大小和平均ACR显示在补充图2中。对于大多数位点，扩增子大小范围为160–180 bp，ACR范围为0.65–0.85。首先，我们从1144个位点中选择了ACR最高的465个位点（>0.76）。然后，进一步选择了大小较小的200个位点。

讨论

在本研究中，我们开发了一种基于NGS的200-SNP基因分型方法，该方法适用于个体识别。即使使用少量DNA（60 pg/反应），该方法也能获得高一致性（>95%）。在加入腐殖酸和BSA的实验中，该方法表现出良好的抑制耐受性和较高的恢复率。我们使用微操作技术分离出的少量细胞（2–10个细胞）进行了200-SNP分型，发现三个细胞的分型一致性很高。

资助

本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）KAKENHI的资助，资助编号为JP25K13647。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。