高分辨率质谱技术和酶联免疫吸附测定法用于检测肉毒杆菌中毒小鼠模型中的残留肉毒杆菌浓度

《Legal Medicine》：High-resolution mass spectrometry and enzyme-linked immunosorbent assay for detection of residual botulinum concentrations in a mouse model of botulism

肉毒毒素A型检测方法优化：建立小鼠中毒模型对比LC-MS/MS与ELISA检测效果，发现ELISA在2小时内可灵敏检测肌肉组织残留毒素，而质谱法在低浓度下存在局限性。

　　

李东清|梁俊彦|陈颖|吴向雷

武汉大学泰康医学院微生物学系（基础医学科学），中国湖北省武汉市430071

摘要

背景

A型肉毒杆菌毒素被广泛用于阻断乙酰胆碱的释放，以治疗慢性流涎、肌肉痉挛和肌张力障碍。我们的目标是开发一种用户友好的方法来检测肉毒杆菌毒素中毒病例。

方法

通过注射或灌胃Botulax?建立小鼠中毒模型，并观察中毒剂量和症状。分别使用高分辨率质谱和夹心ELISA检测中毒小鼠体内的毒素残留水平。

结果

中毒后两小时，在我们特定的非靶向工作流程和样品制备条件下，质谱（MS）未检测到残留的肉毒杆菌毒素，但ELISA在多种小鼠组织中检测到了残留毒素，其中肌肉组织中的毒素水平最高。无论中毒途径如何，同一器官内的毒素残留水平没有明显差异。夹心ELISA方法适用于检测肉毒杆菌毒素中毒。暴露两小时后，可以在多种组织中检测到毒素残留，其中肌肉是最优的采样组织。

结论

我们的研究表明，在特定的样品制备、色谱分离和非靶向检测条件下，质谱可能无法有效检测到低于ng/ml浓度的肉毒杆菌毒素。该研究证明ELISA是一种敏感且实用的早期检测方法。尤其是在从肌肉组织取样时，可以在中毒后2小时内检测到阳性结果。

引言

肉毒杆菌毒素主要由产孢的Clostridium botulinum产生，少量也可能由C. butyricum和C. pasteurism产生。肉毒杆菌毒素抑制神经肌肉接头处的乙酰胆碱释放，导致肌肉松弛和麻痹[1]。医用级肉毒杆菌神经毒素（BoNTx）可用于临床治疗皱纹、面神经痉挛和各种类型的疼痛（如偏头痛）。尽管有完善的指南和操作程序支持BoNTx的临床应用，但由于个体敏感性差异或药物从注射部位扩散到预期区域之外的情况，患者仍可能出现毒性反应。肉毒杆菌中毒是一种罕见但危及生命的疾病，其特征是弛缓性下行性麻痹，最初表现为脑瘫，随后可能发展为肢体无力、呼吸衰竭甚至死亡[2]。肉毒杆菌中毒可能通过摄入含有毒素的食物（食物中毒）、肉毒杆菌毒素污染的伤口（伤口肉毒杆菌中毒）或肠道（婴儿肉毒杆菌中毒和成人肠道定植肉毒杆菌中毒）发生，也可高浓度用于美容或治疗性注射（医源性肉毒杆菌中毒）[3]。此外，接触肉毒杆菌毒素气溶胶形成的有毒环境可能导致吸入中毒，这种形式具有生物恐怖主义的潜在威胁，应被视为严重威胁。及时诊断和精确使用抗毒素是治疗肉毒杆菌中毒的关键；因此，有必要改进检测方法。

液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和高分辨率质谱的分析技术可以在全扫描模式下收集选定质量范围内的所有信息[4,5]；它们的数据收集特点包括高分辨率和高灵敏度。最近的报告展示了使用LC-MS/MS在样品中检测ng/mL水平肉毒杆菌毒素的应用[6]。

然而，由于管理高纯度肉毒杆菌毒素的安全问题，目前只有少数授权机构使用该方法检测样品中的肉毒杆菌毒素含量；此外，目前没有公开可用的肉毒杆菌毒素A型质谱数据库。本研究首次使用市售的肉毒杆菌毒素A型（产品名称：Botulax?）作为标准物质来建立肉毒杆菌中毒的小鼠模型。通过夹心ELISA检测中毒小鼠血清、粪便和器官中的肉毒杆菌毒素残留水平，以确定方法的灵敏度、最佳采样类型和理想的时间窗口。

部分内容

伦理声明和生物安全

所有实验方案均获得上海第九人民医院伦理委员会的批准（SH9H-2020-A279-1）。所有方法均按照AVMA指南和规定进行。所有涉及肉毒杆菌毒素的程序均在生物安全等级2（BSL-2）实验室中由受过培训的人员执行，他们佩戴了适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、手套和安全眼镜。所有废弃物

肉毒杆菌毒素A型质谱库的构建

对提取的肉毒杆菌毒素A型（Botulax?）总蛋白进行酶水解后，通过质谱鉴定出三个可信的肽段（图1）。通过数据库检索和分析，发现肽段1和2的序列与蛋白质附件P0DPI1和P0DPI0相匹配，这些是肉毒杆菌神经毒素A（Botulinum toxin protein A）的片段。肽段2的序列与蛋白质附件Q45894相匹配

讨论

随着“医疗美容”的普及，现在可以通过医疗手段获得肉毒杆菌毒素。尽管药品制造商声称医用肉毒杆菌毒素是安全可靠的，并且需要医生的处方，但某些地区的监管缺陷使得没有医疗资质的机构也能进行注射相关操作；甚至出现了非法使用医用肉毒杆菌毒素复制品的情况[[9], [10], [11]]。

结论

总之，虽然医用肉毒杆菌毒素A型通常很安全，但过量使用仍有可能导致中毒，且非注射途径引起的中毒早期症状更为隐匿，由于就医延迟可能会对身体造成严重伤害。我们的研究结果表明，在特定的样品制备、色谱分离和非靶向检测条件下，质谱未能检测到BoNT/A，而ELISA则显示出敏感性和实用性

CRediT作者贡献声明

李东清：概念构思、方法学设计、数据分析、撰写——初稿；梁俊彦：方法学设计、数据分析；陈颖：数据管理、方法学设计、数据分析；吴向雷：概念构思、方法学设计、数据分析、验证、资金获取、资源协调、监督、撰写——审稿与编辑。

知情同意

不适用。

伦理批准

所有实验方案均获得上海第九人民医院伦理委员会的批准（SH9H-2020-A279-1）。所有方法均按照AVMA指南和规定进行。所有方法均按照ARRIVE指南进行报告。

资助

本研究得到了上海科技创新行动计划（21dz1200300）的资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

不适用。