保留细胞外基质的脱细胞淋巴结切片：构建用于基质细胞培养的类淋巴微环境平台

《Scientific Reports》：Decellularized lymph node sections with preserved extracellular matrix for stromal cell culture

本研究针对现有淋巴结（LN）脱细胞支架厚、细胞接种不均、成像困难等问题，开发了一种结合振动切片术和去垢剂脱细胞的方法，制备出薄层脱细胞淋巴结（dLN）切片。该dLN切片保留了细胞外基质（ECM）成分和力学性能，支持小鼠和人类成纤维网状细胞（FRC）长期培养及与T细胞共培养，并兼容高分辨率成像和流式细胞术分析，为研究LN微环境中细胞-ECM相互作用提供了新型工具。

　　

在免疫系统的精密调控中，淋巴结（Lymph Node, LN）作为核心器官，是启动和调节适应性免疫应答的关键场所。其内部，尤其是副皮质区，由特化的基质细胞——成纤维网状细胞（Fibroblastic Reticular Cells, FRCs）——构建了一个错综复杂的细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）纤维网络。这个高度组织化的ECM微环境，由胶原蛋白、糖胺聚糖（Glycosaminoglycans, GAGs）、蛋白聚糖和糖蛋白等构成，不仅为免疫细胞提供结构支撑，更通过其生化与力学信号，精确引导着免疫细胞的迁移、活化与相互作用，如同城市中的道路与信号系统，指挥着免疫大军的行动。然而，在癌症、慢性炎症以及自身免疫性疾病（如1型糖尿病）等病理状态下，这一精密的“道路系统”常常遭到破坏，ECM的结构与成分发生改变，例如出现片段化的透明质酸（Hyaluronic Acid, HA）或胶原重塑，这些变化被证实会促进疾病进展。尽管ECM在免疫稳态和疾病中的作用日益凸显，但由于现有模型的局限性以及对动物实验的依赖，深入研究细胞与LN ECM相互作用的机制仍然面临挑战。传统的全器官脱细胞方法虽能保留ECM特征，但产生的支架通常较厚且致密，限制了细胞的均匀接种、营养物质的扩散，并且不利于高分辨率成像分析。因此，亟需开发一种能够更好地模拟天然LN微环境、并便于进行精细化细胞生物学研究的新型平台。

为了解决上述问题，研究人员在《Scientific Reports》上发表了他们的最新成果。他们开发了一种创新性的方法，将振动切片术与去垢剂脱细胞法相结合，成功从小鼠和人类组织中制备出薄层的脱细胞淋巴结（Decellularized Lymph Node, dLN）切片。这项研究旨在创建一个保留天然ECM特性、同时允许均匀细胞接种、长期培养和高通量分析的类淋巴支架，为深入探索基质细胞-ECM相互作用及其在免疫调节和疾病中的作用提供了强有力的工具。

研究人员开展此项研究主要运用了几个关键技术方法：首先，利用振动切片机将小鼠（NOD和C57BL/6J品系）和人类（来自遗体捐赠者）的淋巴结在特定浓度（如6%）的琼脂糖中包埋后，切割成200微米厚的薄片。接着，采用优化的去垢剂脱细胞方案（主要使用0.1%十二烷基硫酸钠[SDS]和1% Triton X-100）对淋巴结切片进行处理，以有效去除细胞成分并保留ECM。通过DNA定量、ECM成分（GAGs和总胶原）定量、免疫荧光染色和原子力显微镜（AFM）等技术，系统评估了脱细胞效果及ECM的保留情况（包括力学性能）。然后，将分离自小鼠或人类淋巴结的成纤维网状细胞（FRCs）接种到dLN切片上进行三维培养，并利用生物发光法长期监测细胞活性。最后，建立了有效的酶消化法从培养后的dLN切片中回收细胞，用于流式细胞术分析细胞表型（如gp38和PDGFRα表达），并构建了FRCs与抗原特异性T细胞（NY8.3 CD8+ T细胞）的共培养体系，以评估dLN切片支持免疫细胞相互作用的能力。

Decellularization protocols remove DNA from mouse lymph nodes and vibratome sections

研究人员首先评估了脱细胞方案的效果。通过Quant-iT PicoGreen? dsDNA检测法量化DNA含量，发现经过优化的Protocol B（0.1% SDS结合1% Triton X-100处理3小时）能有效将小鼠淋巴结切片中的DNA含量降至极低水平，显著低于公认的完全脱细胞阈值（50 ng/mg）。组织学H&E染色进一步证实，脱细胞后的dLN切片中细胞核和胞质成分被完全清除，同时保留了ECM的架构。这表明该脱细胞方案能够高效去除细胞物质。

Decellularization protocol retains extracellular matrix components and mechanical properties

接下来，研究验证了脱细胞后ECM成分和力学性质的保留情况。生化定量分析显示，dLN切片中的糖胺聚糖（GAG）和总胶原浓度与未脱细胞的对照组相比无显著差异。原子力显微镜（AFM）测量表明，dLN切片的弹性（杨氏模量）与天然LN组织相当，但变异性降低，提示脱细胞过程在保留整体力学性能的同时，可能减少了由于细胞存在导致的局部异质性。免疫荧光染色清晰地显示，胶原IV、层粘连蛋白（Pan-Laminin）和纤连蛋白（Fibronectin）等关键ECM蛋白在脱细胞后依然存在并保持了一定的空间组织。

Decellularized lymph node sections enable murine FRC culture,characterization, and co-culture with T cells

核心部分在于验证dLN切片的功能性。将小鼠（NOD品系）来源的FRCs以不同密度接种到dLN切片上，并进行长达28天的培养。生物发光实时监测表明，FRCs在dLN切片中能够存活、增殖，活性在培养14天左右达到峰值。通过建立细胞数与发光值的标准曲线，确定每个dLN切片最多可支持约25,000个活细胞。免疫荧光染色证实，培养14天后，dLN切片内的FRCs表达了α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白（Vimentin）和胶原I等成纤维细胞和ECM相关标志物，显示出与基质整合的良好形态。研究人员还成功优化了从dLN切片中提取FRCs的方案（Method 5），提取的细胞能形成活性的单细胞悬液。流式细胞术分析显示，与传统的二维（2D）培养相比，在dLN切片中培养14天的FRCs，其表型标志物gp38（一种FRC特征性标记）和PDGFRα（血小板衍生生长因子受体α，一种成纤维细胞标记）的表达发生了改变。这种变化具有品系特异性：原本gp38表达较低的NOD FRCs在dLN微环境中gp38表达有适度增加；而原本gp38表达较高的B6 FRCs则保持了较高的gp38表达，但PDGFRα表达降低。这提示dLN微环境能够影响FRCs的表型。最后，共培养实验证明，在dLN切片上预培养并经干扰素-γ（IFN-γ）和抗原肽处理的FRCs，能够有效地将抗原呈递给抗原特异性（NY8.3）CD8+ T细胞，诱导T细胞增殖和活化标志物CD44的上调，而未加抗原的对照组则无此效应。这表明dLN切片平台能够支持功能性的FRC-T细胞相互作用。

Decellularization protocols apply to human LNs and support human FRC culture

为了验证该平台的转化潜力，研究进一步将方法应用于人类遗体捐赠者来源的淋巴结。结果表明，脱细胞后的人类LN切片DNA含量也低于50 ng/mg的阈值，证明了方案在不同物种间的适用性。将人类FRCs接种到人类dLN切片上后，其活性在21天的培养期内保持稳定。免疫荧光染色显示，人类FRCs能够在dLN基质中整合，并表达F-肌动蛋白（F-actin）和α-SMA等标志物，同时胶原I等ECM结构保持完整。这充分说明该平台同样适用于人类组织研究，为利用临床样本进行疾病建模奠定了基础。

综上所述，本研究成功建立了一种结合振动切片和优化脱细胞技术的新方法，制备出薄层、ECM保留良好的脱细胞淋巴结（dLN）切片。该平台有效克服了传统厚层脱细胞支架的局限性，证实了dLN切片能够支持小鼠和人类成纤维网状细胞（FRCs）的长期（分别达28天和21天）三维培养、表型分析以及与T细胞的功能性共培养。研究结果强调，与2D培养相比，dLN微环境能够动态调节FRCs的表型标志物（如gp38和PDGFRα）的表达，展示了ECM微环境对细胞行为的重要影响。此外，该平台兼容高分辨率成像和流式细胞术等下游分析技术。这项工作的意义在于，它提供了一个高度仿生、操作灵活且功能强大的体外模型，极大地便利了在接近生理状态的背景下研究淋巴结基质细胞与细胞外基质（ECM）的相互作用、免疫细胞跨对话以及其在健康与疾病（如自身免疫病、癌症）中的机制。这不仅深化了对淋巴组织微环境功能的理解，也为未来开发针对ECM相关疾病的免疫工程策略和个性化医疗方案提供了新的实验基础和转化前景。