基于系统发育代谢组学的海洋放线菌源SARS-CoV-2 3CLpro抑制剂发现及其作用机制研究

《Scientific Reports》：Identification of SARS-CoV-2 3CLpro inhibitors from marine actinomycetes through integrated phylogeny-based metabolomics with functional screening and bioinformatic analysis

本研究针对新冠病毒关键药物靶点3CLpro，从菲律宾海洋沉积物放线菌资源中筛选高效抑制剂。研究人员通过系统发育分析结合非靶向代谢组学技术，发现7个系统发育群系的链霉菌代谢提取物具有显著抑制活性（IC50 2.43-8μg/mL），鉴定出streptocarbazole C等17种标志性代谢物。分子对接显示streptocarbazole C与3CLpro催化中心结合能达-9.8kcal/mol，为开发新型抗冠状病毒药物提供了候选分子和研究方法框架。

　　

当COVID-19大流行逐渐从全球急性威胁转变为常态性公共卫生挑战时，抗病毒药物的研发储备依然是应对未来新发突发传染病的关键防线。SARS-CoV-2作为导致COVID-19的病原体，其生命周期中一个至关重要的环节依赖于主要蛋白酶（3CL^pro，又称M^pro）的活性。这种蛋白酶负责切割病毒复制过程中产生的大分子多聚蛋白，形成具有功能性的非结构蛋白，从而驱动病毒的复制和转录过程。由于3CL^pro在人体中没有同源物，针对该酶的抑制剂可能具有高特异性和低毒性，使其成为理想的抗病毒药物靶标。

天然产物及其衍生物一直是药物发现的重要来源，其中微生物来源的化合物尤其引人注目。放线菌作为次级代谢产物的宝库，历史上为人类贡献了众多抗生素和抗病毒药物。海洋环境中的放线菌，由于生活在高压、高盐、低温和寡营养的特殊生境中，进化出了独特的代谢途径和生物合成机制，能够产生结构新颖、活性多样的化合物。菲律宾海域的海洋沉积物环境，如被联合国教科文组织列为世界遗产的图巴塔哈群礁自然公园和诺加斯岛，拥有高度多样化的海洋生态系统，是发现新微生物资源和活性先导化合物的理想场所。

本研究旨在从菲律宾诺加斯岛和图巴塔哈群礁的海洋沉积物中分离的75株放线菌中，寻找能够有效抑制SARS-CoV-2 3CL^pro的活性菌株及其活性成分。研究团队采用了一种综合性的研究策略，将系统发育学、代谢组学、功能筛选和生物信息学分析相结合，以期高效地发现具有开发潜力的抗病毒先导化合物。

为开展此项研究，研究人员主要运用了几项关键技术。首先，从两个地理位置的海洋沉积物样本中复苏并培养了75株放线菌，通过液体发酵和有机溶剂萃取获得粗提物。其次，利用荧光共振能量转移（FRET）活性测定法高通量筛选这些粗提物对SARS-CoV-2 3CL^pro的抑制活性，并计算半数抑制浓度（IC₅₀）。对活性菌株进行16S rRNA基因测序和系统发育分析，明确其分类学地位和进化关系。进而，采用液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC-QTOF-MS）进行非靶向代谢组学分析，通过主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）等多元统计方法，挖掘与抑制活性相关的代谢物标志。最后，对潜在活性分子进行分子对接模拟，预测其与3CL^pro靶点的结合模式和亲和力，并利用ProTox-II平台进行计算机体内毒性预测。

筛选结果与系统发育分析

初筛结果显示，36%（27株）的放线菌粗提物在10 μg/mL浓度下对3CL^pro的抑制率超过90%。进一步测定27个活性提取物的IC₅₀值分布在2至8 μg/mL之间，显示出显著的抑制强度。其中，菌株DSD454的活性最强，IC₅₀值为2.43 μg/mL，与阳性对照GC376的1.57 μg/mL（3.09 μM）接近。系统发育分析将27个活性菌株划分为7个不同的进化支（Clade）。其中，Clade 1、5和6的菌株表现出最强的抑制活性，它们分别与Streptomyces enissocaesilis、S. geysiriensis、S. ardesiacus以及S. indicus等物种亲缘关系密切。

代谢组学分析揭示活性相关代谢物

非靶向代谢组学分析结合多元统计分析成功地将活性菌株按代谢谱进行区分。PCA和层次聚类分析（HCA）显示，具有高抑制活性的Clade 1和Clade 5的菌株代谢谱高度相似，而活性较弱的Clade 3和Clade 7则表现出更大的代谢多样性。通过OPLS-DA模型，研究人员筛选出17个与3CL^pro抑制活性显著相关的判别代谢物（VIP > 1）。这些代谢物涵盖了倍半萜（如albaflavenone）、芳香聚酮（如streptokordin）、烷基酚（如anaephene A）、脂肪酸衍生物（如多种酰胺）、烷基化芳香胺以及卡巴唑生物碱（如streptocarbazole C）等多种结构类型。

分子对接预测相互作用机制

分子对接分析旨在预测这些潜在抑制剂与SARS-CoV-2 3CL^pro的结合能力。结果显示，卡巴唑生物碱streptocarbazole C（化合物21）的结合亲和力最强，达-9.80 ± 0.30 kcal/mol，优于阳性对照GC376（-7.67 ± 0.03 kcal/mol）。该化合物能与3CL^pro活性中心的多个关键残基形成广泛的相互作用网络，包括与催化双元体之一的HIS41形成π-阳离子相互作用，与CYS145形成氢键和π-供体氢键，并与GLU166、SER144、GLY143、LEU141和GLN189等残基形成常规氢键或碳氢键。这些相互作用表明streptocarbazole C能够稳定地结合在酶的活性口袋，可能有效阻断底物与酶的结合，从而抑制其蛋白酶活性。其他一些代谢物，如倍半萜类化合物，也显示出中等的结合亲和力。

计算机毒性预测评估安全性

利用ProTox-II平台对筛选出的候选代谢物进行了器官特异性毒性预测。结果显示，神经毒性是最常见的预测不良反应，在12种化合物中有9种被预测存在此风险。化合物21（streptocarbazole C）除神经毒性外，还被预测存在呼吸毒性。化合物18（anaephene A）和24（亚油酰乙醇酰胺）未预测到器官毒性，显示出相对较好的安全性前景。所有受评化合物均未预测出肝毒性或心脏毒性。

结论与意义

本研究通过整合系统发育学、功能代谢组学和计算生物学方法，成功地从菲律宾特定海洋环境的放线菌资源中挖掘出对SARS-CoV-2 3CL^pro具有抑制潜力的代谢物。研究不仅证实了海洋放线菌，特别是来自特定生态位的链霉菌，是发现新型抗病毒先导化合物的重要资源，而且鉴定出多个与抑制活性相关的特征性代谢物，其中streptocarbazole C通过分子对接显示出与靶点极强的结合潜力。这些发现为后续针对3CL^pro的抗病毒药物先导化合物的优化和开发奠定了坚实的基础。研究所采用的多学科交叉研究策略，也为从复杂微生物体系中快速发现活性天然产物提供了可借鉴的框架。未来工作需要对这些候选化合物进行分离纯化、结构确证、体外酶活和细胞水平抗病毒验证，以及更深入的临床前安全性评价，以切实推动其向药物研发方向转化。该研究成果已发表在《Scientific Reports》期刊上。