新型荧光标记异硫氰酸酯衍生物：一种极具潜力的癌症诊疗一体化工具

《Scientific Reports》：New fluorescently labeled isothiocyanate derivatives as a potential cancer theranostic tool

本研究针对癌症诊疗分离的难题，设计并合成了系列荧光标记的异硫氰酸酯（ITC）衍生物。通过系统评估不同荧光团（NBD、DNS等）和连接链长度对化合物抗癌活性及细胞穿透性的影响，发现所有衍生物均展现出优于参考化合物萝卜硫素（SFN）的抗癌活性和选择性，其中NBDC6NCS对前列腺癌细胞的IC50值较SFN降低超30倍。该研究成功构建了兼具实时成像功能与治疗效应的诊疗一体化探针，为癌症精准医疗提供了新策略。

　　

癌症被视为20世纪和21世纪的瘟疫，不仅侵蚀患者健康，更对社会各层面造成沉重负担。尽管科学家不断探索新的诊断和治疗方法，但癌症发病率和死亡率的统计数据依然触目惊心。世界卫生组织强调，早期诊断是降低癌症死亡率的关键因素之一。在此背景下，"诊疗一体化"（theranostics）概念应运而生，它旨在开发一种能同时实现成像诊断和对癌细胞产生选择性细胞毒性的单一构建体。

目前，荧光成像因其低侵入性和极高灵敏度，在诊疗一体化工具开发中备受关注。然而，现有的荧光药物如多柔比星（Doxorubicin, DOX）虽兼具荧光和抗癌活性，却缺乏对癌细胞的选择性，导致严重的全身性副作用，限制了其诊疗应用。与此相反，异硫氰酸酯（Isothiocyanate, ITC）类化合物，特别是从十字花科蔬菜中提取的萝卜硫素（Sulforaphane, SFN），展现出对癌细胞的显著选择性和良好的安全性，但其缺乏内在荧光特性，无法用于实时追踪。

为解决这一矛盾，波兰格但斯克大学的研究团队在《Scientific Reports》上发表了创新性研究成果。他们设计、合成并系统研究了一系列新型荧光标记的ITC衍生物，将荧光团（负责成像）与ITC基团（负责生物活性）通过连接链共价结合，成功构建了兼具诊断和治疗功能的双功能分子。

研究人员主要运用了化学合成、高效液相色谱（HPLC）纯度验证、光谱分析（测定最大吸收和发射波长）、细胞培养（使用前列腺癌PC3细胞、乳腺癌T47D细胞和正常人真皮成纤维细胞HDFa）、MTT法测定细胞活力和半数抑制浓度（IC₅₀）、荧光显微镜进行细胞成像、积累和滞留动力学分析等关键技术方法。

化学合成

研究团队合成了五种荧光标记的SFN类似物（图1），其结构包含ITC基团、不同长度的碳链（C4或C6）以及四种不同类型的荧光团：7-硝基苯并呋喃（NBD）、5-（二甲氨基）萘（DNS）、9,10-二氢吖啶酮（Akr）和10-甲基-9,10-二氢吖啶酮（MeAkr）。

此外，还合成了两组对照化合物：一组用甲磺酰基（Mesyl）或甲苯磺酰基（Tosyl）取代荧光团（图2），以评估荧光团本身对活性的影响；另一组则将ITC基团替换为N-乙酰基（图3），以确认ITC基团是抗癌活性的关键。

所有化合物均通过质谱和核磁共振氢谱（1H NMR）确认结构，HPLC分析显示纯度均高于95%。并在PBS缓冲液（pH 7.4）中测定了它们的最大吸收和发射波长（表1），为细胞成像实验提供了参数依据。

荧光衍生物萝卜硫素对癌细胞具有活性

MTT实验结果表明，所有荧光标记的ITC衍生物均表现出比SFN更强的抗癌活性。例如，带有NBD荧光团和四碳链的衍生物NBDC4NCS，对PC3和T47D细胞的IC₅₀值（分别为3.3 μM和2.8 μM）比SFN（分别为33.5 μM和30.4 μM）低约10倍（图4A, B；表2）。更重要的是，这些衍生物保持了选择性，对正常HDFa细胞的毒性较低。选择性指数（SI = IC₅₀(HDFa) / IC₅₀(癌细胞)）分析显示，所有荧光衍生物的SI值均大于1，且多数高于SFN，表明其对癌细胞有更好的选择性（表2；图7）。

荧光显微镜观察证实，NBDC4NCS能有效穿透细胞膜并在细胞内积累（图4C）。不同荧光团对活性影响显著，其中NBD和MeAkr衍生物活性最强，而DNS和Akr衍生物活性相对较弱，但仍与SFN相当或更强（图5A-F；表2）。

对照实验明确显示，ITC基团是抗癌活性所必需的。当ITC基团被N-乙酰基取代后，化合物完全丧失了抗癌活性（图S34）。而用Mesyl或Tosyl基团取代荧光团后，化合物虽保留部分活性，但远低于相应的荧光衍生物（表3），说明荧光团的引入增强了ITC的活性。此外，延长连接链长度（从C4到C6，即NBDC6NCS）可显著提高抗癌活性和选择性（NBDC6NCS对PC3细胞的IC₅₀低至1.0 μM，SI高达5.8）（表2；图7）。

SFN衍生物的荧光标记使其能够在细胞中被追踪

荧光标记的核心优势在于能够实时追踪化合物在细胞内的行为。研究发现，NBDC4NCS在处理5分钟后即可在PC3细胞内检测到，并随时间推移不断积累（图8）。初步积累部位呈现线粒体样形态，提示线粒体可能是ITCs的作用靶点之一。随着时间延长，化合物也出现在细胞核和囊泡结构中。

荧光强度与化合物浓度呈正相关，使得定量分析成为可能（图9）。

滞留实验表明，即使在移除培养基中的化合物后，细胞内的荧光信号仍能持续检测长达24小时（图10），证明了这些衍生物在细胞内的长期留存能力，这对于持续的药效观察具有重要意义。

结论与讨论

本研究成功验证了新型荧光标记ITC衍生物作为癌症诊疗一体化工具的巨大潜力。研究结论明确指出，ITC基团是衍生物抗癌活性的主要贡献者，而连接的荧光团和连接链的长度则能显著增强其活性和选择性。其中，以NBD为荧光团、六碳链连接的衍生物（NBDC6NCS）表现最为突出。

这项研究的深远意义在于，它首次在全球范围内报道了共价连接荧光团与ITCs的合成与系统性研究。所获得的化合物不仅作为抗癌药物候选物具有应用前景（其活性和选择性优于SFN），更重要的是，它们作为独特的研究工具，可用于实时监测ITCs在细胞和活体中的分布、积累、滞留时间、代谢途径以及作用机制（如初步观察到的线粒体靶向）。这为理解ITCs的生物学效应提供了前所未有的可视化手段。

尽管本研究聚焦于24小时内的急性效应，但其结果为进一步开展长期效应、深入机制探索以及体内动物实验奠定了坚实基础。荧光标记的ITC衍生物，特别是基于NBD的探针，因其稳定性（C-N键连接在还原环境下稳定）和优异的光学性质，有望成为研究生物机制和疾病诊疗的强大工具。这项研究顺应了诊疗一体化的医学新趋势，将诊断成像组件（荧光团）与治疗组件（ITC基团）整合于单一分子中，为癌症患者带来了新的希望，也为科学家和医生提供了强大的新型研究手段。