模拟转移性肿瘤微环境：基于肺癌与血管类器官共培养平台的药物评估新模型

《Scientific Reports》：Modeling the metastatic tumor microenvironment: a co-culture platform of lung cancer and blood vessel organoids for drug evaluation

本刊推荐：为破解肿瘤细胞-血管互作在肺癌转移中的复杂动态，研究人员构建了血管化肺癌类器官(VLCO)共培养模型。该平台成功模拟了癌细胞沿血管网络迁移、上皮-间质转化(EMT)及血管周细胞-成纤维细胞转化(PFT)等关键病理过程，证实TGF-β/PDGF-BB信号轴驱动微环境重塑。研究建立了标准化药物反应评估体系，证明TGF-β抑制剂Galunisertib可有效抑制EMT，为抗转移治疗提供了新型高通量筛选工具。

　　

肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，而肿瘤转移是导致治疗失败和患者死亡的主要原因。在转移过程中，癌细胞需要与肿瘤微环境（TME）中的各种成分进行复杂的相互作用，其中肿瘤血管扮演着至关重要的角色。它们不仅为肿瘤提供氧气和营养，更是癌细胞逃离原发灶、进入血液循环的“高速公路”，这一过程被称为内渗（intravasation）。然而，传统的二维细胞培养模型难以模拟人体内三维的、动态的肿瘤-血管界面，而动物模型则存在成本高、通量低、物种差异大等问题，极大地限制了对肿瘤转移机制的研究和有效药物的开发。

为了解决这一瓶颈问题，来自Gradiant Bioconvergence Inc.、成均馆大学医学院、延世大学医学院等机构的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们开发了一种名为“血管化肺癌类器官”（VLCO）的新型三维共培养模型，将肺癌类器官（LCOs）与血液血管类器官（BVOs）结合在一起，旨在实验室中高度模拟肺癌转移的微环境，为深入研究肿瘤-血管相互作用及药物筛选提供了强大的平台。

研究人员为构建这一模型，主要采用了以下几项关键技术：利用人诱导多能干细胞（hiPSCs）定向分化生成包含内皮细胞、周细胞等多种血管细胞的BVO；从肺癌患者的手术切除肿瘤组织或恶性胸水样本中分离培养出具有患者特异性的LCO；通过将两者以特定比例混合并在基质胶（Matrigel）中三维共培养，形成VLCO assembloids（组装体）；并综合运用免疫荧光染色、实时定量PCR（qPCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术等多种分子生物学技术进行表征和机制探讨。

Intravasation modeling with lung cancer organoids and BVOs（肺癌类器官与BVO共培养模拟内渗）

研究人员首先建立了LCOs与BVOs的共培养体系。他们将BVO解离成单细胞，而将LCOs机械破碎成小团块，共同包埋于基质胶中。在长达21天的共培养过程中，可以清晰地观察到LCOs沿着BVO形成的血管网络迁移，并最终侵入血管样结构。为了特异性追踪癌细胞的行为，研究团队构建了表达红色荧光蛋白（RFP）的LCOs，并发现来源于胸水（被认为侵袭性更强）的LCOs比来源于手术肿瘤的LCOs表现出更强的向BVO内部迁移的能力。通过流式细胞术和图像分析定量证实，大量RFP阳性的肺癌细胞确实进入了BVO内部，成功在体外模拟了癌细胞的内渗过程。

LCO and BVO undergo EMT and PFT during coculture（共培养诱导LCO发生EMT及BVO发生PFT）

那么，是什么机制驱动了癌细胞的迁移和内渗呢？研究者推测类器官之间可能通过分泌因子进行通信。通过Transwell间接共培养实验（允许分子交换但避免细胞直接接触），他们发现共培养条件诱导LCOs发生了上皮-间质转化（EMT），表现为EMT相关基因（如ZEB2， TWIST1）的上调；同时，BVO中的周细胞则表现出向癌症相关成纤维细胞（CAF）样细胞的转化，即周细胞-成纤维细胞转化（PFT），其特征是成纤维细胞标志物（FSP1， FAP）上调而周细胞标志物（PDGFRβ， NG2）下调。进一步检测发现，共培养上清液中TGF-β和PDGF-BB的浓度显著升高。这表明，LCOs分泌的PDGF-BB可能诱导BVO发生PFT，而BVO来源的TGF-β则驱动LCOs发生EMT，二者以旁分泌形式共同塑造了促转移的微环境。

VLCO model for assessing vasculature-induced EMT（VLCO模型用于评估血管诱导的EMT）

为了建立一个更标准化、易于进行药物筛选的模型，研究团队将LCOs和BVOs都解离成单细胞，以优化比例混合后在超低吸附板中培养，使其自组装形成复合类器官（VLCO）。在VLCO中，RFP标记的LCOs在培养第5天开始沿着发育中的血管结构迁移。免疫荧光分析证实，这些迁移的LCOs高表达ZEB2和TWIST1，而上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达缺失，间质标志物N-钙黏蛋白（N-cadherin）表达上调，明确发生了EMT。此外，在VLCO内的LCOs中还检测到缺氧诱导因子HIF-1α的表达，提示缺氧环境也可能参与了EMT的诱导。

Stromal remodeling and fibrosis in VLCOs（VLCO中的基质重塑与纤维化）

肿瘤微环境的另一个关键特征是基质重塑和纤维化。在VLCO模型中，研究者观察到了显著的周细胞募集现象，这些周细胞聚集在LCO团块周围。更重要的是，这些BVO来源的细胞逐渐表达成纤维细胞标志物FSP1和FAP，表明它们确实向CAF样细胞分化。同时，VLCO中出现了明显的纤维化特征，包括纤维连接蛋白（Fibronectin）以及I型和III型胶原（Collagen I/III）在肿瘤-基质界面的大量沉积，这些细胞外基质成分的积累形成了类似体内肿瘤的纤维化屏障。

Drug response assay established using VLCOs（基于VLCO建立药物反应评估体系）

研究最大的亮点在于将VLCO模型应用于药物评价。他们以TGF-β1受体抑制剂Galunisertib为例，测试其对血管诱导的EMT的抑制作用。结果显示，在两种易发生EMT的LCOs（029T， 077T）构建的VLCO中，Galunisertib处理能显著抑制LCOs的迁移扩散，且呈浓度依赖性，而对非EMT类型的LCOs（136T， 3057T）则无明显影响。ELISA和qPCR分析进一步证实，Galunisertib有效降低了培养上清中的TGF-β1水平，并下调了EMT（MMP2）和基质重塑（FAP， Fibronectin）相关基因的表达。此外，研究还测试了抗血管生成药物贝伐珠单抗（bevacizumab），发现其能有效抑制BVO的增殖和血管化，并伴随LCO迁移能力的下降，再次印证了血管组分在驱动肿瘤恶性进展中的核心作用。

Long-term culture induces EMT in VLCOs（长期培养进一步促进VLCO的EMT）

最后，研究者观察了长期培养（32天）对VLCO表型的影响。发现随着培养时间的延长，VLCOs持续生长，体积增大，其内部的LCOs逐渐完全丧失E-钙黏蛋白表达，N-钙黏蛋白表达进一步增强，表明长期培养可加剧EMT进程，使癌细胞获得更彻底的间质特性。

综上所述，该研究成功构建了一个高度模拟体内肿瘤-血管相互作用的三维类器官共培养模型——VLCO。该模型不仅重现了癌细胞沿血管迁移、内渗、EMT、PFT和基质纤维化等转移相关的关键事件，还揭示了TGF-β/PDGF-BB信号轴在这一过程中的核心调控作用。更重要的是，研究证实VLCO可作为一款强大的平台，用于筛选靶向肿瘤血管互作和EMT的抗转移药物，例如TGF-β抑制剂和抗血管生成药物。尽管该模型目前尚缺乏免疫细胞等更多微环境组分，且无法模拟血流剪切力等物理因素，但其在模拟人类肿瘤生物学、推动转化医学研究方面已展现出巨大潜力。未来，结合更多患者来源的样本和单细胞组学技术，VLCO模型有望在揭示肿瘤转移机制、开发个体化治疗方案以及加速抗癌药物研发中发挥越来越重要的作用。