泰国耳念珠菌多药耐药性的基因组复杂性研究：新突变与潜在通路探索

《Scientific Reports》：A study of genomic complexity underlying multidrug resistance in Candida auris strains in Thailand

本研究针对新兴多重耐药真菌耳念珠菌（Candida auris），利用长读长纳米孔测序技术对泰国临床分离株进行全基因组分析，揭示了与氟康唑和卡泊芬净耐药相关的典型及新型遗传变异，包括ERG11 Y132F和FKS1 I1361T等突变，并首次发现CDC10及真菌特异性转录因子等潜在新耐药通路，为理解其耐药机制及临床防控提供了重要基因组学依据。

　　

在真菌感染领域，耳念珠菌（Candida auris）正成为全球公共卫生的新威胁。自2009年首次从日本患者耳道分离以来，这种新兴病原体以其对多种一线抗真菌药物的耐药性和医院内传播能力引发广泛关注。尤其令人担忧的是，许多临床分离株表现出多重耐药（multidrug resistance）甚至泛耐药（pan-drug resistance）特性，对氟康唑（fluconazole, FL）、卡泊芬净（caspofungin, CS）等常用药物均不敏感，给临床治疗带来严峻挑战。

尽管前期研究已发现一些与耐药相关的基因突变，如ERG11基因Y132F突变与氟康唑耐药、FKS1基因热点区突变与卡泊芬净耐药相关，但耳念珠菌耐药性的全基因组复杂性仍未被完全阐明。特别是在泰国等东南亚地区，耳念珠菌的基因组特征和耐药机制尚缺乏系统研究。

为深入解析耳念珠菌多药耐药的基因组基础，泰国玛希隆大学西里拉医院的研究团队对8株来自曼谷临床分离的耳念珠菌进行了全面研究。该研究采用牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technology）进行长读长全基因组测序，结合抗真菌药敏试验（antifungal susceptibility testing, AST），系统分析了不同耐药表型菌株间的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）及其对应的氨基酸替换突变。

研究团队主要运用了以下几项关键技术：首先通过纳米孔长读长测序技术完成全基因组测序和de novo组装，利用BRAKER2和Funannotate流程进行基因预测和功能注释；其次采用酵母一号药敏板（YeastOne YO10）和肉汤微量稀释法（broth microdilution, BMD）进行抗真菌药敏试验；最后通过Snippy和Clair3流程进行变异检测，并利用最大似然法构建系统发育树分析菌株间进化关系。

多药耐药谱分析

研究人员将8株耳念珠菌根据对氟康唑和卡泊芬净的敏感性分为三组：SI-CAU-425和503对两种药物均敏感（S/S）；SI-CAU-390、713、757和1199对氟康唑耐药但对卡泊芬净敏感（R/S）；而SI-CAU-605和672对两种药物均耐药（R/R）。药敏试验显示，氟康唑耐药菌株的MIC值均大于256 mg L^-1，而卡泊芬净耐药菌株的MIC值大于8 mg L^-1，显著高于临界值。

基因组组装与特征

基因组测序产生了高质量的组装结果，基因组大小在11.6-12.8 Mb之间，GC含量约为45%。所有菌株预测基因数在5,388-5,675个之间，其中注释蛋白编码基因约3,000个，假设蛋白基因约2,400个。菌株SI-CAU-713和757的组装连续性相对较低，但仍可用于后续分析。

系统发育与变异分析

基于核心SNPs构建的系统发育树显示，菌株按耐药表型明显聚类：氟康唑敏感菌株（425和503）形成独立分支，而氟康唑耐药菌株聚在一起，其中卡泊芬净耐药菌株（605和672）亲缘关系最近。这表明基因组差异与耐药表型存在关联。

研究人员共鉴定出349个SNPs为氟康唑耐药菌株共享（I类），而卡泊芬净耐药菌株仅共享9个SNPs（II类）。进一步分析发现，166个I类SNPs导致氨基酸替换（非同义突变），而II类仅有5个共享非同义突变。

氟康唑耐药相关突变

研究发现，所有氟康唑耐药菌株均携带ERG11基因Y132F突变，这与既往报道一致。该突变通过改变羊毛甾醇14α-脱甲基酶结构，降低氟康唑结合能力，从而介导耐药。同时，ERG4基因M192I突变也在所有氟康唑耐药菌株中发现，提示其可能协同贡献耐药表型。此外，研究还发现多个此前未报道的与氟康唑耐药相关的突变，涉及DNA修复相关蛋白（RAD18、RAD23、RAD52）等。

卡泊芬净耐药相关突变

在卡泊芬净耐药菌株中，研究发现了几类重要突变：首先，CDC10基因G32E突变为两株耐药菌共享。CDC10编码septin蛋白亚基，参与细胞壁完整性调控，其突变可能影响菌株对卡泊芬净的敏感性。其次，菌株672独特性携带FKS1基因I1361T突变，该位置不属于已知的热点区（hotspot-1、hotspot-2或hotspot-3），可能是新型耐药突变。此外，研究还发现一个含有Zn(II)₂-Cys₆双核簇结构域的真菌特异性转录因子发生S275L突变，该蛋白与其他致病念珠菌中的多药耐药调节蛋白2（multidrug resistance regulator 2, MRR2）同源，可能通过调控外排泵或细胞壁合成基因表达影响耐药性。

假设蛋白功能分析

对卡泊芬净耐药菌株共享突变的假设蛋白进行结构域分析发现，其中一个蛋白含有真菌特异性转录因子结构域（PF00172和PF04082）。InterProScan分析确认其属于转录因子家族，与白色念珠菌MRR2等蛋白功能相似，提示其可能通过调控CDR1等外排泵基因表达影响药物外排。

本研究通过基因组学方法系统揭示了泰国耳念珠菌临床分离株的多药耐药遗传基础，不仅验证了已知耐药突变（如ERG11 Y132F），还发现了多个新型候选突变。特别值得注意的是，卡泊芬净耐药菌株中发现的CDC10突变和真菌特异性转录因子突变，为理解echinocandin类药物耐药机制提供了新视角。研究发现也强调了耳念珠菌耐药性的复杂性，除经典突变外，可能涉及细胞壁完整性、药物外排等多条通路协同作用。

然而，研究也存在一定局限性，如样本量较小，且鉴定出的新型突变需通过基因编辑等技术进行功能验证。此外，卡泊芬净存在的 paradoxical growth effect（PGE）现象也可能影响体外药敏结果的解读，未来需结合体内实验进一步验证。总体而言，该研究为耳念珠菌耐药机制研究和临床耐药性监测提供了有价值的基因组数据，对指导抗真菌药物使用和防控医院感染具有重要意义。