基质细胞与特定生长因子协同增强水凝胶中3D内皮网络形成的机制研究及其在无外源成分培养中的应用

《Scientific Reports》：3D endothelial network formation in hydrogels improved by stromal cells and specific growth factors

本研究针对体外构建人体组织/类器官缺乏功能性血管网络的瓶颈问题，系统探讨了在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与基质细胞（人牙髓干细胞DPSCs/人脂肪干细胞ASCs）共培养体系中，利用天然水凝胶（Matrigel、GelMA）及无外源成分（xeno-free）VitroGel水凝胶形成三维血管网络的优化条件。研究发现，血管内皮生长因子（VEGF）并非培养基中诱导血管网络形成的必需因子，而胰岛素样生长因子1（IGF1）、碱性成纤维细胞生长因子（FGF2）和表皮生长因子（EGF）通过刺激基质细胞，能有效促进内皮网络形成，且该效果在无血清及化学成分确定的培养基中依然显著。该研究为组织工程中血管化构建体的临床转化提供了重要的无外源成分培养策略。

　　

在当今的生物医学研究领域，体外培育具有功能性的三维人体组织或类器官已成为现实，然而，这些构建体普遍面临一个严峻挑战——缺乏能够有效输送氧气、营养物质并清除代谢废物的功能性血管网络。这一“无血管”的局限严重制约了较大组织构建体的存活、成熟以及最终在再生医学中的实际应用。传统的二维细胞培养模型难以模拟体内复杂的细胞微环境，而三维培养体系，尽管更接近生理状态，但其成功高度依赖于合适的支架材料（如水凝胶）、特定的细胞类型以及精确的培养基组成。其中，应用广泛的Matrigel虽然为多种干细胞（包括人多能干细胞）的分化提供了良好的支持，但其源自小鼠肿瘤的动物源性以及批次间的差异性，使其在临床转化应用中存在隐患。此外，内皮细胞在纯Matrigel中自发形成稳定、广泛的三维网络的能力一直备受质疑，这促使研究人员不断探索更优的血管化策略。

为了解决上述难题，由Ivana Acimovic、Vaclav Chochola、Jose Luis Herrera、Ales Hemp及Josef Jaros组成的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们致力于开发一种能够在三维水凝胶中，特别是在Matrigel中，高效形成内皮网络的方法，并深入探讨其背后的关键驱动因素，最终目标是建立化学成分确定且无外源成分的培养条件，为未来临床应用铺平道路。

研究人员综合运用了多种关键技术方法开展本研究。他们采用了创新的三维共培养系统，将内皮细胞（HUVECs）与基质细胞（DPSCs或ASCs）共同包埋于不同水凝胶（包括Matrigel、甲基丙烯酰化明胶GelMA以及多种无外源成分的VitroGel水凝胶）中，并置于特制的琼脂糖环内以标准化培养条件。研究系统评估了不同细胞接种形式（单细胞或球体）、不同基质细胞密度、以及多种培养基成分（特别是生长因子VEGF、IGF1、FGF2、EGF及其组合）对血管网络形成和水凝胶重塑的影响。通过实时荧光定量PCR（qPCR）分析了共培养体系中关键基因的表达变化。利用共聚焦显微镜进行三维成像，并通过ImageJ软件中的Angiogenesis Analyzer插件对形成的血管网络长度、分支点、网格数量等参数进行定量分析。所有实验均设置了多次重复并进行统计学分析。人脂肪干细胞（ASCs）来源于健康捐赠者的吸脂术样本，其使用获得了相关伦理委员会的批准。

Matrigel重塑由DPSCs实现，并支持与HUVECs共培养中的网络形成

研究人员首先建立了一个标准化的三维培养体系，将细胞包埋于圆柱形Matrigel中，外围以琼脂糖环固定。他们发现，无论是作为单细胞还是球体形式，HUVECs在纯Matrigel中都无法自发形成血管网络，即使使用DPSCs条件培养基也无济于事。然而，当DPSCs与HUVECs球体共同包埋于Matrigel中时，情况发生了显著变化。DPSCs的存在不仅诱导了HUVECs伸出突起并相互连接形成网络，还显著促进了Matrigel自身的重塑收缩，且这种效应呈浓度依赖性——DPSCs浓度越高（最高达4.5x10⁶ cells/ml），水凝胶面积收缩越明显，形成的HUVECs网络总长度也显著增加。基因表达分析显示，共培养7天后，基质细胞衍生因子CXCL12、血管内皮生长因子VEGFA、内皮标志物vWF以及基质金属蛋白酶MMP2的表达均上调，提示基质细胞通过旁分泌信号和细胞外基质重塑协同支持内皮网络的形成。免疫荧光染色进一步证实，部分与HUVECs接触的DPSCs表达了α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），表明其可能向周细胞样细胞分化，参与了血管的成熟过程。

培养基成分影响DPSCs在水凝胶中的分布及HUVEC网络形成

培养基的选择对共培养结果至关重要。研究发现，使用内皮细胞生长培养基2（EGM2）时，DPSCs均匀分布在水凝胶中，并导致显著的水凝胶收缩和良好的HUVEC网络形成。而使用间充质干细胞培养基（MSC培养基）时，DPSCs倾向于聚集成束状结构位于水凝胶中央，水凝胶收缩程度较低，HUVEC网络长度也显著短于EGM2组。这表明EGM2中的某些成分能有效促进基质细胞的分散和功能发挥。重要的是，在共培养体系中，DPSCs并未表达内皮标志物CD31，说明其并未向内皮细胞转分化，而是通过支持细胞的作用促进HUVEC自身形成网络。

培养基补充物FCS、抗坏血酸、肝素和氢化可的松对HUVEC网络形成影响不显著

为了解EGM2中哪些成分起关键作用，研究人员首先评估了胎牛血清（FCS）、肝素、抗坏血酸和氢化可的松这四种补充剂的作用。在缺少生长因子但包含这四种补充剂的基础培养基（EBM，即EGM2-GFs）中，逐一剔除其中一种补充剂。结果显示，无论剔除哪一种，都无法支持有效的HUVEC网络形成，且DPSCs的分布和水凝胶的收缩均不理想。这表明，单独这些补充剂并非驱动三维血管网络形成的主要因素。

生长因子IGF1和FGF2是Matrigel中DPSCs与HUVECs共培养诱导网络形成的主要诱导因子

接下来，研究重点放在了生长因子上。令人意外的是，即使将VEGF浓度从EGM2中的0.5 ng/ml提升至100 ng/ml，其单独使用对网络形成的促进作用仍远不及完整的EGM2培养基。相反，当单独测试IGF1、FGF2和EGF时，发现IGF1和FGF2能诱导形成相对更长的网络。更重要的是，IGF1和FGF2的组合（I+F）显示出强大的协同效应，能引起显著的水凝胶收缩，其程度与完整EGM2相当，并且网络长度也显著优于单个因子。在此基础上添加EGF或VEGF，并未能进一步显著提升效果。这说明IGF1和FGF2是诱导三维内皮网络形成的关键驱动因子。

将IGF1和FGF2添加到诱导性较弱的MSC培养基中可改善三维水凝胶中的血管化

为了验证这些生长因子的普适性，研究人员尝试用IGF1和FGF2来“增强”原本不利于血管化的MSC培养基。结果显示，在MSC培养基中添加IGF1和FGF2的组合（I+F）或再添加EGF（I+F+E），能够显著改善DPSCs的分布，促进水凝胶收缩，并诱导形成更长的HUVEC网络。虽然其网络复杂程度（如连接点和网格数）仍低于EGM2，但这一策略成功地将在EGM2中发现的生长因子关键作用转移到了另一种基础培养基中。在另一种水凝胶GelMA中进行的实验也验证了这一结论，表明IGF1和FGF2的组合效应不依赖于特定的水凝胶类型。

HUVECs与ASCs的共培养同样受生长因子IGF1、FGF2和EGF的诱导效应

研究还考察了另一种常用的基质细胞——脂肪来源的基质细胞（ASCs）。尽管ASCs也能支持HUVEC网络形成和水凝胶重塑，但在相同细胞浓度下，其诱导的网络长度略低于DPSCs。然而，在MSC培养基中添加FGF2、EGF或I+F、I+F+E组合，同样能显著促进与ASCs共培养体系中的血管网络形成，表明生长因子的诱导效应在不同类型的基质细胞中也具有普遍性。

IGF1、FGF2和EGF可在无外源成分和化学成分确定的条件下诱导HUVEC网络形成

最后，研究迈向临床转化的关键一步——建立无外源成分（xeno-free）的培养体系。研究人员使用商业化的无外源成分VitroGel水凝胶（特别是COL型）替代Matrigel，并尝试使用无血清（用B27替代FCS）甚至完全无外源成分（去除B27）的培养基。在这些条件下，HUVECs与DPSCs的共培养依然能够实现细胞从球体中伸出以及基质重塑，支持内皮网络的形成。这表明，研究所确定的关键生长因子组合在无外源成分的体系中同样有效，为制备符合临床标准的血管化组织构建体奠定了基础。

综上所述，本研究深入揭示了在三维水凝胶中，特别是传统上认为不利于血管化的Matrigel中，基质细胞（如DPSCs和ASCs）的存在是内皮细胞形成网络的关键。研究突破性地发现，VEGF并非此过程的必需因子，而IGF1和FGF2的生长因子组合通过刺激基质细胞，发挥着核心的驱动作用。这一发现挑战了常规认知，并提供了更优化的培养基配方策略。此外，研究成功地将这一策略应用于无外源成分的水凝胶和培养基中，证明了在化学成分确定且无动物源成分的条件下构建三维内皮网络的可行性。该研究不仅为在Matrigel中培养的类器官等的血管化提供了直接参考，更重要的是，为组织工程和再生医学领域开发临床适用的、功能性的血管化组织构建体奠定了坚实的理论与实验基础，标志着向转化应用迈出了重要一步。