SpCas9内部结构域替换的结构与功能解析：为蛋白质工程开发新型碱基编辑工具

《Scientific Reports》：Structural and functional insights into internal domain replacement in SpCas9 for protein engineering

本研究针对CRISPR-Cas9系统功能扩展中结构完整性保持的挑战，通过结构生物学和生化分析鉴定出SpCas9 C端区域（1242-1263）可作为功能域替换位点。研究人员成功将TadA8e脱氨酶整合至该区域，构建的Cas9-CTD-ABE变体在体外和体内均展现与ABE8e相当的编辑效率，且可通过 linker设计调控编辑窗口，为开发更精准的基因组编辑工具提供了新策略。

　　

在基因组编辑技术飞速发展的今天，CRISPR-Cas9系统已成为生命科学领域最具革命性的工具之一。然而，随着应用场景的不断扩展，研究人员面临着双重挑战：既要保持Cas9蛋白本身的结构完整性和编辑活性，又要为其赋予新的功能特性。传统的N端或C端融合策略虽然简单有效，但往往导致蛋白尺寸过大，特别是在治疗应用中会影响递送效率。更棘手的是，长而灵活的linker可能引入不可预测的空间构象变化，影响编辑精度。

为解决这些难题，科学家们将目光投向Cas9蛋白的内部结构域。与高度保守的催化核心区域不同，C末端结构域（CTD）在不同Cas9同源蛋白中展现出显著的序列和结构多样性，这提示其可能具有更高的工程化耐受性。然而，一个关键问题尚未得到明确解答：是否存在特定的内部区域可以被外源功能域替换，而不会破坏Cas9的整体结构和功能？这个问题的答案对于开发更紧凑、更精准的新型基因编辑器至关重要。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，韩国首尔大学和成均馆大学的研究团队通过多学科方法，成功鉴定出化脓性链球菌Cas9（SpCas9）中的一个关键区域（氨基酸1242-1263），并证明该区域可作为功能域替换的理想位点。研究人员不仅通过生化实验验证了该区域的非必要性，还通过X射线晶体学在分子水平上揭示了替换后的结构完整性，最终构建出具有高效腺嘌呤碱基编辑功能的新型Cas9变体。

研究团队主要采用了以下几种关键技术方法：通过序列比对和结构分析鉴定潜在的可替换区域；利用蛋白质工程手段构建缺失突变体和功能域替换变体；通过体外DNA切割实验和电泳迁移率变动分析（EMSA）评估蛋白功能；采用X射线晶体学解析三元复合物结构（分辨率3.6?）；建立体外脱氨实验体系量化编辑效率；使用大肠杆菌系统进行体内功能验证。实验所用蛋白样本通过原核表达系统获得，并经过多步色谱纯化确保纯度。

设计内部缺失的SpCas9变体

通过比较多种Cas9同源蛋白的多域结构，研究人员发现CTD在氨基酸组成上存在显著差异。特别是SpCas9中1242-1263区域由一个柔性linker和一个α-螺旋组成，与周围结构元素或非靶链（NTS）没有形成广泛接触，且在不同Cas9同源蛋白中完全保守。基于这些观察，研究人员构建了缺失突变体Cas9△CTD22，将该区域替换为短的甘氨酸-丝氨酸 linker（GSGSGSG）。

1242-1263区域对SpCas9活性非必需

通过荧光标记的dsDNA切割实验发现，Cas9△CTD22对含典型TGG PAM序列的DNA切割活性与野生型SpCas9相当。EMSA结果显示，dCas9△CTD22对典型PAM序列的结合亲和力（K_D=21±0.5nM）与野生型（K_D=19±0.5nM）无显著差异。PAM消耗实验进一步证实Cas9△CTD22保持了野生型样的PAM特异性。

缺失1242-1263区域的SpCas9变体的结构评估

研究人员解析了dCas9△CTD22与sgRNA和dsDNA形成的三元复合物晶体结构（分辨率3.6?）。结构分析表明，缺失突变体保持了SpCas9的整体结构架构，与已报道的SpCas9三元复合物结构高度相似（RMSD=0.9?）。替换区域的GS linker在电子密度图中可见，尽管部分丝氨酸残基侧链因柔性而分辨率较低。

将进化的大肠杆菌TadA整合到1242-1263区域并评估脱氨酶活性

为验证该位点的工程化潜力，研究人员用TadA8e（7-167）替换1242-1263区域，构建了五种不同linker的Cas9-CTD-ABE变体（L0、L3、L5、L7、Lh）。体外脱氨实验显示，无linker的L0变体无活性，而柔性linker变体（L3-L7）在A6-A12位置表现出与ABE8e相当的编辑效率，但编辑窗口向PAM近端偏移。刚性螺旋linker（Lh）变体则表现出更窄的编辑窗口。与已报道的Cas9-ABE结构相比，新变体展现出相似或更优的编辑特性。

Cas9-CTD-ABE变体在大肠杆菌中的靶向脱氨作用

体内实验进一步证实了Cas9-CTD-ABE变体的功能。通过HpyCH4IV限制性内切酶分析和靶区测序，研究人员观察到所有测试变体均能特异性脱氨A6和A10位置的腺嘌呤，编辑效率与体外结果一致，而ABE8e在A6位置效率更高。

该研究通过系统的结构生物学和生化分析，证实了SpCas9 CTD中1242-1263区域可作为功能域替换的理想位点。这一发现不仅拓展了SpCas9工程化的设计空间，还为开发更紧凑、更精准的基因编辑工具提供了新思路。特别值得注意的是，通过合理的linker设计，研究人员成功实现了编辑窗口的调控，这表明该平台具有高度的可调性和适应性。

研究的重要意义在于它为解决CRISPR-Cas9工程化中的关键挑战提供了新方案：在保持蛋白结构完整性的同时实现功能扩展。与传统终端融合策略相比，内部结构域替换可产生更紧凑的编辑工具，有利于体内递送和应用。此外，编辑窗口的可调性为特定应用场景的精准编辑提供了可能。

这项研究为蛋白质工程领域提供了宝贵见解，展示了如何通过结合结构生物学指导和合理的功能设计，开发出具有定制功能的新型生物工具。未来，这一平台策略可扩展至其他功能域的整合，如变构调节模块或传感元件，进一步拓展CRISPR-Cas9在生物医学研究和治疗应用中的潜力。随着更多结构信息的积累和理性设计能力的提升，内部结构域工程有望成为开发下一代基因编辑工具的重要方向。