脂质竞争机制驱动ABC转运蛋白外排药物的结构基础与分子动力学研究

《Nature Communications》：Drug-bound outward-facing conformation of a heterodimeric ABC exporter suggests a putative mechanism of drug translocation

本研究针对ABC外排蛋白如何调控药物跨膜转运亲和力这一关键问题，通过冷冻电镜和分子动力学模拟揭示了BmrCD在脂质纳米盘中的药物结合构象。研究人员解析了Hoechst结合的内向（IF）与外向（OF）构象结构，发现脂质分子通过竞争性结合削弱药物-转运蛋白相互作用，从而驱动药物释放。该研究首次提出了脂质介导的底物转运模型，为理解多药耐药性提供了近原子分辨率的机制阐释。

　　

在细胞存活的战场上，ABC转运蛋白如同忠实的守门人，掌控着物质进出细胞的大权。其中一类专门负责外排任务的ABC外排蛋白（ABC exporters），更是以其能够识别并排出结构各异的细胞毒性物质的能力而闻名。然而这种保护机制却是一把双刃剑——当肿瘤细胞过度表达这类转运蛋白时，会产生多药耐药性（multidrug resistance），导致化疗药物被大量泵出细胞，使治疗功亏一篑。尽管科学家们早已知道这些蛋白通过构象变化来转运物质，但一个核心谜团始终悬而未解：在完成将药物从细胞内转运到细胞外的任务后，这些蛋白是如何“放手”让药物离开的？

传统观点认为，ABC转运蛋白采用“交替通道机制”（alternating access mechanism），通过核苷酸结合结构域（NBD）结合和水解ATP来驱动构象变化。底物分子首先结合由跨膜结构域（TMD）形成的内向（IF）腔室，随后腔室方向转变为外向（OF），将底物排出细胞。对于多药ABC外排蛋白而言，两亲性底物可以从脂质双分子层的内叶结合，并被释放到外叶。然而，尽管已有多个药物结合的IF构象结构被解析，药物结合的OF构象结构却十分稀缺，特别是能够在天然脂质双分子层环境中揭示药物释放机制的高分辨率结构更是凤毛麟角。

为了解决这一难题，来自范德堡大学和伊利诺伊大学的研究团队将目光投向了枯草芽孢杆菌中的异源二聚体ABC外排蛋白BmrCD。这项发表在《Nature Communications》上的研究通过单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）和分子动力学（MD）模拟的整合策略，揭示了脂质分子在药物转运过程中意想不到的关键作用。

研究人员主要运用了冷冻电镜结构解析和分子动力学模拟两大关键技术。他们首先将野生型BmrCD在脂质纳米盘中重组，使用Hoechst-33342作为模型底物，通过钒酸盐捕获技术获得ADP-Vi结合的后水解状态。通过收集约660万颗粒并进行三维分类，最终获得了分辨率达3.1?的OF构象结构。分子动力学模拟则基于冷冻电镜结构，在CHARMM36力场下进行了多副本微秒级模拟，分析脂质-药物-蛋白质相互作用的动态过程。

Cryo-EM结构揭示Hoechst结合的BmrCD外向构象

研究人员成功解析了BmrCD与Hoechst结合的外向构象（BmrCD_OF），该结构展示了一个向细胞外侧开放的V形腔室。令人惊讶的是，除了两个以反平行方式排列的Hoechst分子外，结构中还发现了结合在转运蛋白腔室内部或附近的脂质分子。

与IF构象相比，OF构象的胞内侧关闭主要由BmrC的重排贡献，而胞外侧的开放则由BmrD的构象变化执行。跨膜螺旋TM1、TM2、TM3和TM6（BmrC）以及TM4和TM5（BmrD）显示出8-12?的位移，导致胞内侧腔室关闭。同时，胞外侧的TM螺旋向外移动6-15?，形成OF腔室。这些构象变化得到了双电子电子共振（DEER）距离测量的验证，进一步确认了该结构的机制特性。

Hoechst与BmrCD外向腔室的相互作用

清晰的密度图使得研究人员能够详细分析两个Hoechst底物（HT-1和HT-2）在OF构象中与转运蛋白的相互作用。两个Hoechst分子位于BmrC的TM1、TM3和TM6与BmrD的TM5和TM6之间。具体而言，BmrC的D141与HT-1的哌嗪基团形成氢键，而BmrD的D377与HT-2的苯并咪唑基团相互作用。BmrC的Y284通过π-π相互作用与HT-1结合，V283与HT-2形成疏水相互作用。与IF构象类似，对Hoechst结合贡献最大的残基来自BmrC，表明BmrC的相互作用在转运过程中引导Hoechst。

比较IF和OF构象发现，两个Hoechst分子发生了约15-21?的 translocation，从TMD的较低部分移动到较高部分。在IF构象中，两个Hoechst形成43°角，而在OF构象中，它们变得几乎反平行。腔室的溶剂可及体积从IF到OF转变过程中从423?3扩展到4995?3。这一转变的支点似乎位于之前确定的W290_BmrC-H338_BmrD离子锁（ionic latch）附近，这两个残基对Hoechst的结合都至关重要。

MD模拟揭示脂质在Hoechst释放中的关键作用

分子动力学模拟从OF构象开始，揭示了脂质分子进入胞外裂隙的动态过程。特别是标记为POVI5的脂质分子，准备进入蛋白质的胞外裂隙。模拟显示该脂质快速下降进入裂隙，其进入过程被核密度估计分析捕获，显示了膜磷脂可及的高占据区域。

脂质进入腔室的一个后果是破坏了Hoechst的稳定性，如天然接触分析所示。虽然冷冻电镜密度图中Hoechst分子排列整齐，但模拟显示它们开始倾斜，这种倾斜运动打破了BmrCD两条链与Hoechst分子之间形成的几种稳定相互作用。当脂质削弱蛋白质-底物接触时，D141继续紧紧抓住HT-1的带电端，而脂质在HT-2的另一端拉扯，导致观察到的倾斜行为。

在另一个模拟副本中，研究人员观察到HT-1开始离开原始结合位点进入膜中，与POVI5相反。这种脂质-底物相互作用有助于打破D141-HT-1盐桥以及附近的E33_BmrC-R345_BmrD盐桥，使E33能够与暴露的HT-1带电氮形成新的盐桥。同时，HT-2末端的哌嗪基团与BmrD的E51形成盐桥，导致底物快速向ECD结构域 translocation。

脂质结合IF构象

脂质在OF构象中释放Hoechst的作用的发现促使研究人员探究脂质是否在Hoechst结合IF构象中发挥作用。搜索相同的ADP/Vi捕获数据集鉴定出两个分辨率为3.4?的IF构象，两者都有脂质结合在两个Hoechst分子附近。

在一个IF构象（BmrCD_IF1）中，一个POPA分子（标记为POV4）直接与BmrC的H184相互作用，H184是涉及其与R304侧链相互作用的离子“锁”的一部分。在BmrCD_IF1中，由于脂质与H184结合，锁处于开放状态。在第二个鉴定的IF构象BmrCD_IF2中，一个POPC分子（POV23）结合在底物结合腔室中，锁处于关闭位置。

结合脂质松动IF构象中的药物-转运蛋白相互作用

为了探索这些脂质在转运机制中的功能作用，研究人员进行了BmrCD_IF2在存在和不存在结合脂质情况下的MD模拟，监测结合脂质的动力学、所有条件下底物的稳定性以及TM4和TM6之间的距离（H184-R304锁的位置）。

对RH锁的分析表明，存在单个底物分子可稳定较短距离，而引入第二个底物会触发TM4/TM6界面的开放。存在两个脂质分子使界面更加开放，尽管研究人员观察到当脂质在模拟过程中开始离开位点时，界面开始关闭。去除结合脂质分子的模拟显示距离分布中有两个峰。值得注意的是，界面开始关闭，直到一个新的脂质分子从大量脂质中在400纳秒后进入。

监测底物稳定性，研究人员计算了所有HT重原子的原子波动作为所有模拟条件的时间序列。当只有一个HT分子存在时，它可以自由探索宽的BmrCD空腔。相比之下，当两个HT分子结合时，第一个变得更具柔性，并开始与第二个堆积。脂质分子的存在阻止底物堆积，并将第一个底物推向蛋白质的胞外半部分，到达腔室的最内部区域，其顶点。一旦它推动底物，脂质分子离开界面，可能允许转运蛋白从内向开放转变为内向封闭，然后转变为外向开放构象以挤出底物。

研究结论与意义

本研究展示的结构与之前的结构一起，描绘了BmrCD在脂质双分子层中近原子分辨率的构象景观的近乎完整模型。在该模型中，底物耦合循环包括先前描述的Hoechst和Mg²⁺的逐步结合。有和没有Hoechst的BmrCD IF的冷冻电镜结构以及相应的DEER数据表明，结合Hoechst后没有主要的构象变化。

ATP水解，主要是在共识NBS中，触发向OF构象的转变。B因子分析表明，在形成催化NBS之前，NBD在IF状态下是动态的，而ECD在OC和OF状态下变得动态。Hoechst解离后，转运蛋白转变为OC构象。先前的DEER分析表明，脂质纳米盘中OF构象的群体需要Hoechst的结合。与其他ABC外排蛋白相比，药物结合OF构象在BmrCD中的稳定性可归因于ECD等因素，ECD可能增加了药物释放的能量成本，以及胞外侧开放的角度较小，可能促进了与转运蛋白更强的底物相互作用。

与我们的模型独特的是，分析了稳定结合底物到IF和OF中间体的相互作用。Hoechst与两个原体之间的接触是不对称的，BmrC贡献了大多数相互作用的残基。这一发现呼应了之前注意到并在此通过OF构象结构加强的形成构象循环的不对称性。V形胞外腔室的BmrC侧更靠近底物（3.4?），显示更灵活的TM1，以及出口附近的开放。相比之下，BmrD侧离底物更远（8.9?），具有更不灵活的TM1，以及K40_BmrD和R381_BmrD之间的静电相互作用可能阻碍出口。

从结合在OF腔室入口的脂质分子开始，MD模拟描绘了脂质如何破坏Hoechst分子与转运蛋白相互作用的潜在机制。虽然底物从IF到OF腔室移动的驱动力主要由ATP结合和水解的能量贡献，这些能量驱动构象变化，但需要一种从OF构象释放的机制。BmrCD的功能和光谱数据与我们的模型一致。BmrCD在脂质中OF构象的形成需要Hoechst结合。此外，从去垢剂胶束转变为脂质双分子层时，OF稳定性降低。尽管MD模拟没有显示Hoechst释放，可能是由于模拟的时间尺度有限，但它们确实揭示了通过D141的突变 destabilized Hoechst结合，D141是涉及Hoechst结合到IF和OF构象的残基。

底物释放的能量成本取决于其与OF构象相互作用的强度。尽管底物在膜释放侧的浓度较高，但其固有亲和力可能足够弱，以至于其解离是自发的。这种自发解离先前在TM287/TM288的MD模拟中观察到，并归因于OF空腔中水合的变化。或者，对于那些ATP水解发生在OF构象形成之后的转运蛋白，重置为IF构象的能量驱动也可能克服底物与OF状态的低亲和力结合。

然而，这些模型没有明确包括脂质的能量贡献。多药ABC转运蛋白的两亲性底物往往溶于脂质相。实际上，ABC转运蛋白的早期模型提出了一个疏水“真空吸尘器”模型，其中底物分子从膜的内叶结合并被挤到外叶。类似地，多药转运蛋白LmrP的底物空腔中结合的脂质被解释为反映多特异性机制。脂质是两亲性的，它们的高浓度可以克服其与转运蛋白的固有低亲和力，从而驱动与转运蛋白的结合。MD模拟确定，脂质在释放前松动了转运蛋白和底物之间的稳定相互作用。

因此，我们提出了一个多药ABC外排蛋白的底物和脂质之间的动态“竞争”模型。我们认为这种竞争源于底物与这些多特异性转运蛋白的适度亲和力以及脂质的高浓度，脂质可以进入IF和OF构象中相当宽的腔室。脂质分子的不断进入和退出破坏了与结合底物的相互作用，尽管弱脂质亲和力导致在转运蛋白腔室中的短暂停留时间。该模型得到先前其他ABC转运蛋白在IF构象中的MD模拟的支持，其中脂质自发进入腔室。这种动态结合，以及结合状态的无序，可能阻碍通过结构技术可视化腔室中脂质的能力。严格测试该模型需要系统研究BmrCD在不同脂质组成的双分子层中的结构和动力学。最后，这种脂质诱导的底物亲和力调节可能是其他特异性针对两亲性底物的ABC外排蛋白的通用机制。