GlycoGenius：一款高效、便捷的糖链成分鉴定工具

《Nature Communications》：GlycoGenius: a streamlined high-throughput glycan composition identification tool

糖复合物分析自动化工具GlycoGenius的开发与应用。该工具整合了数据可视化、谱库构建、离子峰检测、MS/MS谱自动标注及质量评估等功能，显著提升LC/CE-MS(/MS)数据处理效率，支持N-糖、O-糖及GAGs分析，通过优化 isotopic envelope fitting score（≥0.8）和曲线拟合评分（≥0.5）等质量阈值，实现与手动分析相当的结果，同时发现更多新型糖结构。相较于GlycReSoft等现有工具，GlycoGenius在分析速度（缩短约50%）、准确率（AUC 0.84 vs 0.76）和自动化程度方面更具优势，支持多样本批量处理及 publication-ready 图表自动生成。

　　糖基化是细胞相互作用和功能的关键组成部分，作为分泌分子或细胞糖萼的一部分，这些复杂的碳水化合物在维持细胞环境的稳定性和调节多种生理和病理过程方面发挥着重要作用。糖基化模式影响信号传导、细胞间和细胞-病原体相互作用、黏附、迁移、蛋白质折叠和稳定性、生长调控、细胞分化以及通过激活或抑制特定通路的免疫调节等细胞功能。由于这些广泛的功能，糖基化在健康和疾病研究中具有重要的临床意义，其异常可能成为治疗靶点或诊断标志物。然而，糖基分析的复杂性仍然是一个挑战，特别是在使用液相色谱-质谱（LC-MS）或毛细管电泳-质谱（CE-MS）技术时，数据的高维度和多样性使得手动分析变得繁琐且低效。

现有的糖基分析工具虽然功能强大，但大多缺乏完全的自动化和集成能力，导致研究人员需要大量的人工干预来处理和分析数据。例如，一些工具虽然能够生成糖基结构图、查询数据库、考虑不同的化学修饰、生成模拟碎片以及匹配质量与电荷比（m/z）值，但它们在处理LC/CE-MS数据时的自动化程度有限，限制了其实际应用。此外，这些工具通常无法提供全面的数据可视化，也难以自动整合多个文件中的分析结果，导致数据处理效率低下，并增加了出错的可能性。

为了克服这些限制，研究人员开发了GlycoGenius，这是一款专为糖基组学数据处理设计的自动化软件。GlycoGenius能够提供从原始数据到可发表图表的完整分析流程，包括数据可视化、构建搜索空间、识别、评分、定量糖基、过滤结果以及注释N-和O-糖基、糖胺聚糖（GAGs）等的碎片光谱。该工具的特点是操作简便，支持多种操作系统，并且能够处理复杂的多样本数据集，使得研究人员能够直接比较不同样本和样本组的分析结果。

在功能上，GlycoGenius的界面设计直观，便于不同专业背景的用户使用。它能够自动识别糖基信号，并创建专门的提取离子色谱图/电泳图（EIC/EIE），同时准确注释单同位素峰和带电状态，以减少手动数据整理的需求。此外，该工具还包含一个先进的去卷积算法，能够高效地去同位素并解析不同的加合物。通过自动计算每个糖基峰的面积（AUC）并支持基于内部标准的自动归一化，GlycoGenius提高了结果的可重复性。它还支持对多个样本进行同时分析，并自动计算质量标准指标，如同位素分布峰拟合、色谱图/电泳图峰形状评分以及质量准确度误差，以提供全面的质量评估，帮助用户排除低置信度的识别和定量结果。

GlycoGenius还支持多种化学修饰，如还原端标签、单糖修饰、磷酸化和硫酸化，并能够检测同一色谱图中的多个峰，从而实现对同质量分子（isobaric compounds）的准确定量。这在处理复杂数据集时尤为重要，因为同质量分子可能具有不同的结构，而手动识别和区分它们非常困难。此外，该工具能够自动生成符合糖基符号命名法（SNFG）的糖基结构图，使得研究结果更容易被理解和发表。

在性能测试中，GlycoGenius表现出与手动分析或现有工具相当的分析能力，同时显著减少了处理时间。例如，在分析总血浆N-糖基组数据时，GlycoGenius在1小时50分钟内完成了174个独特的N-糖基识别，而手动分析仅识别了158个。此外，它还发现了59个在原始研究中未被识别的N-糖基，其中46个在文献中未见报道。对于O-糖基组分析，GlycoGenius在1小时40分钟内识别了25个O-糖基，而使用GlycReSoft则需要3小时才能完成相同任务。这些结果表明，GlycoGenius在处理复杂糖基组数据时，不仅提高了效率，还增强了准确性。

GlycoGenius的分析流程分为几个主要步骤，包括构建糖基组成搜索空间、预处理和追踪EIC/EIE、详细分析每个EIC/EIE的峰，以及后追踪处理和注释MS/MS光谱。在构建搜索空间时，用户可以指定单糖的范围或自定义列表，并根据所需的化学修饰和加合物/电荷范围生成所有可能的糖基组成。预处理阶段，GlycoGenius会将原始数据文件转换为标准格式（如mzML或mzXML），并估算噪声水平，以提高数据处理的准确性。追踪EIC/EIE阶段，软件会搜索每个糖基组成和加合物组合对应的m/z值，并根据用户设定的容差范围进行匹配。随后，通过拟合高斯曲线，软件会计算每个峰的AUC，并根据同位素分布的匹配度和质量误差进行评分。

在处理MS/MS光谱时，GlycoGenius会检查每个碎片是否与前体糖基的组成匹配，并根据碎片的m/z值和强度进行注释。该工具还能够通过分析不同MS/MS光谱中的碎片，生成糖基结构图，并提供详细的定量信息。此外，GlycoGenius还支持多种数据可视化功能，如交互式的二维地图，将RT/MT作为x轴，m/z值作为y轴，颜色编码强度，以便研究人员快速评估数据质量和糖基的存在情况。它还提供了一个快速追踪功能，允许用户自定义颜色并同时追踪多个m/z值，进一步提高了数据处理的灵活性和效率。

GlycoGenius在处理尿液糖胺聚糖（GAGs）数据时也表现出色。通过自动追踪EIC/EIE，它能够识别大多数GAGs峰，并计算它们的强度和质量误差。尽管某些峰由于信号强度不足或与杂质峰重叠而未能被识别，但GlycoGenius仍然能够检测到大多数重要的糖基组成，并提供详细的定量信息。此外，该工具还能够生成符合SNFG标准的糖基结构图，便于研究人员在发表时使用。

GlycoGenius的优势在于其高度自动化的分析流程和强大的数据处理能力。与现有的工具相比，它不仅能够处理多样本数据集，还能够提供更全面的质量评估和更直观的数据可视化。通过使用优化的算法和参数设置，GlycoGenius能够在较短的时间内完成复杂的糖基组分析，同时保持高精度。这些功能使得研究人员能够更高效地处理和分析糖基数据，从而更深入地理解糖基化在健康和疾病中的作用。

未来，GlycoGenius将继续发展，以满足更广泛的需求。例如，研究人员计划集成GlycReSoft的糖基肽识别结果作为输入库，从而实现糖基蛋白质组学的分析。此外，该工具还将增强对糖基结构的自动确定能力，以生成更精确的糖基结构图。其他改进功能包括RT/MT修剪器、基于PASTAQ的增强RT/MT对齐工具，以及与糖基结构数据库（如GlyTouCan）的集成。这些功能将进一步提高GlycoGenius的性能和易用性，使其成为糖基组学研究的首选工具。

总的来说，GlycoGenius的推出为糖基组学研究提供了强大的支持，不仅提高了分析效率，还增强了结果的准确性和可重复性。通过自动化处理复杂的糖基数据，该工具使得研究人员能够更专注于糖基化在生物过程中的功能研究，而不是数据处理本身。这为糖基组学的进一步发展和应用奠定了坚实的基础，同时也为相关疾病的机制研究和潜在治疗靶点的发现提供了新的可能性。