WEE1抑制剂通过GCN2介导的整合应激反应激活引发细胞毒性新机制

《Nature Communications》：WEE1 inhibitors trigger GCN2-mediated activation of the integrated stress response

本研究揭示了WEE1抑制剂（WEE1i）通过直接激活GCN2激酶触发整合应激反应（ISR）的新机制。研究人员通过全基因组筛选发现，WEE1i的细胞毒性不仅依赖于其已知的细胞周期调控功能，还通过激活GCN2-eIF2α-ATF4通路导致翻译抑制。该发现为理解WEE1i的脱靶效应提供了新视角，并为开发更特异的WEE1i治疗方案提供了理论依据。

　　

细胞周期的精确调控对维持基因组稳定性至关重要，而WEE1激酶在这一过程中扮演着"刹车"角色。作为CDK1和CDK2的关键负调控因子，WEE1通过磷酸化CDK的Tyr15位点抑制其活性，从而防止DNA复制未完成或DNA损伤的细胞提前进入有丝分裂。正是基于这一机制，WEE1抑制剂（WEE1i）被开发用于癌症治疗，特别是在TP53突变型肿瘤中显示出良好前景。然而，临床观察发现患者对WEE1i的治疗反应存在显著差异，提示除TP53状态外，还有其他因素影响WEE1i的疗效。

近期发表在《Nature Communications》上的研究由Rinskje B. Tjeerdsma、Timothy F. Ng和Maurits Roorda等科学家共同完成，他们发现WEE1i能意外激活整合应激反应（ISR），这一发现为理解WEE1i的作用机制提供了全新视角。

为了揭示WEE1i敏感性的决定因素，研究团队采用了多种前沿技术方法。他们首先通过单倍体遗传筛选和CRISPR-Cas9全基因组筛选系统鉴定影响WEE1i敏感性的关键基因；利用蛋白质组学（SILAC）和核糖体分析（Ribo-seq）研究翻译调控变化；采用单分子成像技术（socRNA）实时观察核糖体动力学；通过NanoBRET分析评估小分子与激酶的相互作用；并结合流式细胞术、免疫印迹等功能实验验证分子机制。

WEE1抑制剂敏感性的遗传决定因素

研究人员首先在HAP1细胞中进行了基因陷阱病毒插入突变筛选，发现除了已知的叶酸代谢途径基因（如MTHFD1、MTHFD2等）外，多个氨基酸-tRNA合成酶和翻译调控因子（如EIF2A）的缺失会增强细胞对AZD1775的敏感性。在RPE1 TP53KO和OVCAR3细胞中敲除EIF2A证实了其对WEE1i的增敏作用，但这种敏感性增加与DNA复制压力或DNA损伤水平无关。

WEE1抑制通过GCN2激活整合应激反应

进一步的机制研究表明，WEE1i处理能显著降低全局mRNA翻译水平，这种效应可被ISR抑制剂ISRIB逆转。CRISPR筛选结果显示，GCN2（EIF2AK4）及其共激活因子GCN1（GCN1L1）的缺失赋予细胞对WEE1i的抗性。实验证实，GCN2KO或ATF4KO细胞对WEE1i的敏感性降低，表明ISR通路在介导WEE1i毒性中起关键作用。

ISR诱导与细胞周期失调是WEE1i的独立效应

研究人员发现，WEE1i引起的GCN2激活不依赖于细胞周期状态，在G1期阻滞的细胞中同样可观察到ATF4上调。重要的是，GCN2抑制并不影响WEE1i诱导的DNA损伤（γH2AX焦点形成）和G2/M检查点 override，表明ISR激活和细胞周期紊乱是WEE1i的两个独立作用机制。在原代外周血单核细胞中同样观察到WEE1i诱导的ISR激活，提示这一现象具有普遍性。

WEE1i改变对翻译扰动的反应

CRISPR筛选还发现，核糖体质量控制（RQC）通路基因（如ZNF598、PELO等）的缺失会增强细胞对WEE1i的敏感性。单分子成像显示，WEE1i处理导致核糖体在Xbp1（S255A）暂停序列上的堆积增加，表明碰撞诱导的核糖体回收受损。这种核糖体动力学改变依赖于GCN2，且需要持续翻译的参与。

WEE1i以脱靶方式激活GCN2

令人惊讶的是，研究发现WEE1i诱导的ISR激活不依赖于WEE1本身。siRNA敲低WEE1并不阻止ISR激活，而NanoBRET和激酶谱分析显示，多种WEE1i（AZD1775、Debio 0123等）能直接与GCN2激酶结构域结合。这种结合需要GCN1的存在，且依赖于持续翻译，表明WEE1i通过变构激活机制直接激活GCN2。

WEE1i与PKMYT1i的协同作用不依赖ISR激活

最后，研究人员探讨了联合治疗策略。发现低剂量Debio 0123（不诱导ATF4表达）与PKMYT1抑制剂RP-6306联合使用，能在不激活ISR的情况下产生协同细胞毒性，这为降低WEE1i脱靶毒性提供了潜在策略。

本研究系统阐明了WEE1抑制剂的双重作用机制：一方面通过抑制WEE1导致细胞周期检查点失效和DNA损伤积累；另一方面通过直接激活GCN2触发整合应激反应。这一发现不仅深化了对WEE1i作用机制的理解，也为优化治疗策略提供了重要线索：针对GCN2激活特性，可开发更特异的下一代WEE1i；利用低剂量WEE1i与PKMYT1i的协同效应，可在保持疗效的同时减少ISR相关毒性；对于RQC通路缺陷的肿瘤，现有WEE1i可能特别有效。该研究为WEE1抑制剂的精准医疗应用奠定了理论基础，对改善癌症治疗效果具有重要意义。