等位基因分辨的纳米孔测序揭示人类胎盘甲基化组图谱及其印迹基因调控

《Nature Communications》：An allele-resolved nanopore-guided tour of the human placental methylome

本研究利用纳米孔测序技术对8例女性胎盘 trio 样本进行等位基因分辨的全基因组甲基化分析，解决了传统短读长测序在检测等位基因特异性甲基化（DMR）和印迹基因方面的技术局限。研究人员构建了高精度的单倍型甲基化图谱，新发现184个DMR和ILDR2、RASA1等新型印记基因，揭示了胎盘特异性印迹调控与RAS/MAPK通路、免疫调节的关联，为理解胎盘发育和妊娠疾病机制提供了新视角。

　　

作为连接母体与胎儿的关键桥梁，胎盘在哺乳动物妊娠过程中扮演着多重角色：它既是营养交换的枢纽，又是激素分泌中心，还承担着免疫调节功能。这个临时器官展现出独特的表观遗传特征——整体低甲基化水平、大量部分甲基化域（PMD）的存在以及丰富的印迹基因表达模式。然而，由于技术限制，以往研究难以在全基因组范围内高精度解析父母源等位基因的特异性甲基化模式，阻碍了对胎盘发育调控机制的深入理解。

为突破这一瓶颈，Michaela Kindlova等研究团队在《Nature Communications》发表最新研究，采用牛津纳米孔测序技术（ONT）对8例女性胎盘 trio 样本（胎盘组织及父母外周血）进行深度测序。通过长读长测序结合父母本基因分型，首次实现了胎盘全基因组范围的等位基因分辨甲基化图谱构建，为揭示胎盘特异性表观调控机制提供了全新视角。

关键技术方法包括：对昆士兰家族队列（Queensland Family Cohort）的8例女性胎盘进行>20×纳米孔全基因组测序和30×Illumina测序，利用WhatsHap进行单倍型分型，通过Megalodon检测5mC甲基化，采用DSS软件识别差异甲基化区域（DMR），并整合EM-seq甲基化测序验证，同时开展100M读长的胎盘RNA-seq进行等位基因特异性表达分析。

Comprehensive allele-resolved methylation profiling

研究团队通过纳米孔长读长测序成功将胎盘基因组分为母源和父源单倍型，发现胎盘整体甲基化水平显著低于心脏、肝脏等体组织，且呈现双峰分布特征。染色体水平分析显示除X染色体外，低甲基化区域集中分布于部分甲基化域（PMD）。

特别值得注意的是X染色体表现出的克隆性失活模式——通过等位基因特异性甲基化分析发现XIST启动子区域存在亲本特异性甲基化差异，这与胎盘组织中X染色体随机失活的克隆扩增特征一致。在 locus 特异性层面，研究确认了IGF2/H19、GNAS等已知DMR，同时新发现723个DMR（184个为本研究首次报道），其中94%的位点通过EM-seq验证具有高度一致性。

Examples of regions with notable allele-specific methylation patterns

典型案例如染色体19 miRNA簇（C19MC）呈现显著的父源等位基因低甲基化模式，该区域包含约50个父源表达的miRNA，与滋养层分化密切相关。

更引人注目的是在chr19q区域发现的SST1巨卫星重复序列，其父源等位基因呈现与重复单元位置对应的周期性甲基化波动，且转录起始于差异甲基化区域上游的完整HERVH逆转录转座子，提示内源性逆转录病毒在胎盘转录创新中的驱动作用。

Properties of placental DMRs

与淋巴母细胞系NA19240相比，胎盘DMR显著偏向父源低甲基化（ paternal demethylation）。

跨组织比较显示胎盘DMR在其他组织/细胞系中差异甲基化程度更低，表明其具有高度胎盘特异性。这种父源低甲基化优势与基因组冲突假说（genetic conflict hypothesis）相吻合——父源基因组倾向于促进胎盘生长，而母源基因组则调控资源合理分配。

Allele-specific expression

通过等位基因分辨的转录组分析发现，虽然整体基因表达变异主要来源于个体差异，但DMR附近基因的表达差异显著受亲本来源影响。研究鉴定出74个印迹基因（FDR<0.25），包括14号染色体MEG3/8/9位点的母源表达非编码RNA簇和C19MC位点的父源表达miRNA。

Discovery of previously unreported imprinted genes

研究首次报道ILDR2和RASA1作为新型印迹基因。ILDR2显示父源低甲基化和父源特异性表达，该B7样蛋白通过调节T细胞活性可能参与母胎免疫耐受；RASA1则呈现母源低甲基化和母源表达特征，作为RAS/MAPK通路的抑制因子，可能通过调控滋养细胞增殖参与胎盘发育。

此外，研究还发现TUSC3和WNT2等基因存在"表观多态性"（epipolymorphism），即DMR甲基化状态在个体间存在变异，但仍对应等位基因表达偏倚。

Genome variation

胎盘体细胞突变分析显示每个样本平均携带186个点突变，其中102个为VAF显著低于0.5的体细胞突变。结构变异分析发现一例44.7 kbp的胎盘特异性重复，涉及CNDP1基因和ZNF407启动子，导致ZNF407驱动下的CNDP1异常表达。

本研究通过纳米孔测序技术成功绘制了高精度的等位基因分辨胎盘甲基化图谱，不仅验证了数百个已知DMR，更发现184个新型DMR和多个潜在印迹基因。这些发现为理解胎盘发育的表观遗传调控提供了全新视角：RASA1的母源印迹符合基因组冲突假说中母源基因组抑制过度生长的预测，而ILDR2的父源印迹则可能通过免疫调节支持胎盘生长。研究建立的等技术方法为后续探索印迹基因与妊娠疾病关联奠定了方法学基础，而女性胎盘的聚焦分析则为揭示性别特异性胎盘适应机制开辟了新路径。随着队列规模的扩大和男性胎盘样本的纳入，这一研究框架有望在发育起源健康与疾病（DOHaD）领域产生更深远影响。