最后防线抗生素达托霉素的双重抗菌机制：独立于细胞壁前体脂质的膜去极化与脂质域簇协同作用

《Nature Communications》：The last resort antibiotic daptomycin exhibits two independent antibacterial mechanisms of action

本期推荐一项发表于《Nature Communications》的重要研究。针对达托霉素（Daptomycin）抗菌机制长期存在的争议——究竟是膜去极化为主还是抑制细胞壁合成更关键，研究团队通过时间分辨荧光显微术、无细胞壁L-形式模型及基因敲除株实验，首次明确达托霉素存在两种独立作用机制：其一是通过与细胞壁前体脂质（如lipid II）及磷脂酰甘油（PG）形成三元复合物，扰乱膜脂质域并抑制细胞壁合成；其二是直接作用于膜磷脂引发去极化，且不依赖细胞壁前体脂质。该双机制模型解释了既往体内外研究矛盾，为多重耐药革兰阳性菌感染防治及新型抗生素开发提供了新视角。

　　

在抗生素耐药性日益严峻的全球健康危机中，达托霉素作为治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和万古霉素耐药肠球菌（VRE）等革兰阳性耐药菌感染的“最后防线”药物，其临床地位至关重要。然而自上世纪80年代上市以来，达托霉素的抗菌机制始终是微生物学界争论的焦点。早期研究认为其通过抑制细胞壁合成发挥杀菌作用，而美国FDA批准的说明书却将膜去极化列为主要机制。更令人困惑的是，体外实验显示达托霉素可形成离子选择性膜孔，而体内实验却观察到延迟的膜透化现象，且该现象与细菌自溶过程难以区分。这种机制认知的分歧不仅阻碍了新型抗生素的理性设计，也对临床耐药性防控策略的制定构成了挑战。

为破解这一谜题，由纽卡斯尔大学Henrik Strahl和查尔默斯理工大学Michaela Wenzel共同领导的研究团队，在《Nature Communications》上发表了题为“The last resort antibiotic daptomycin exhibits two independent antibacterial mechanisms of action”的研究论文。团队通过巧妙的实验设计，首次证实达托霉素并非通过单一机制，而是通过互不依赖的双重途径发挥抗菌作用：一方面通过靶向细胞壁前体脂质抑制肽聚糖合成，另一方面直接引起膜电位消散且不依赖前体脂质相互作用。这一发现为理解达托霉素的独特药理特性提供了全新框架。

研究主要依托四种关键技术方法：一是时间分辨荧光显微术，采用SYTOX Green膜透化染料和电压敏感染料DiSC₃(5)实时监测膜完整性及电位变化；二是利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）自溶酶缺陷株（ΔlytABCDEF）区分原发与继发膜损伤；三是构建无细胞壁L-形式模型及uppS敲除株（无法合成十一异戊二烯耦联前体脂质），解析机制与细胞壁合成的关联；四是通过liaH等应激反应基因敲除株，结合尼罗红染色揭示IM30同源蛋白LiaH在脂质域簇形成中的作用。所有菌株均使用标准实验室保存株，未涉及临床样本队列。

达托霉素诱导枯草芽孢杆菌自溶而非膜孔形成

通过SYTOX Green膜透化实验发现，达托霉素处理枯草芽孢杆菌后出现的延迟荧光信号并非由膜孔直接引起。在野生型中，25分钟处理导致30-40%细胞裂解（相位亮细胞），而存活的相位暗细胞大多未被染料染色。

自溶酶缺陷株（ΔlytABCDEF）中，达托霉素仍能结合细胞但不再引发SYTOX Green信号增强，证实观察到的膜透化是自溶导致的次级效应。

无自溶条件下达托霉素仍不形成膜孔

在自溶缺陷株中，即使使用高浓度达托霉素（10 μg/ml）延长处理时间，细胞仍保持膜完整，与阳性对照尼菌素（nisin）的快速孔道形成形成鲜明对比。

达托霉素通过其固有荧光氨基酸犬尿氨酸检测证实可结合细胞膜，但该结合不直接导致大孔形成。

金黄色葡萄球菌中达托霉素引发缓慢去极化且无孔形成

在重要病原体金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中，达托霉素引起浓度依赖性的渐进式膜去极化（DiSC₃(5)释放），但即使处理60分钟，仅极少细胞出现SYTOX Green阳性。

这表明达托霉素的膜去极化能力是保守的，且与孔道形成机制分离。

脂质域簇形成依赖细胞壁前体脂质而去极化独立

利用能合成脂质II但无法构建细胞壁的L-形式模型，发现达托霉素仅在存在十一异戊二烯耦联前体脂质时才能诱导FM 5-95标记的流体膜域簇集。

相反，在缺乏uppS的L-形式中，达托霉素仍能通过DiSC₃(5)检测到显著去极化，证明去极化机制独立于前体脂质。

静止期细胞中达托霉素结合减少但仍可引发去极化

静止期细胞因磷脂酰甘油（PG）含量降低导致达托霉素结合减少，但增加浓度后仍可诱发去极化，说明该机制不依赖活跃生长。

大尺度脂质域簇依赖IM30同源蛋白LiaH

在枯草芽孢杆菌中，达托霉素诱导的尼罗红染色大脂质域簇在liaH缺陷株中消失，转为全膜分布的小域。

而缺乏LiaH同源物的金黄色葡萄球菌仅出现细微脂质重排

，表明LiaH在簇集三元复合物中起关键作用。

研究最终提出统一模型

：钙离子-达托霉素寡聚体既可结合PG与脂质II形成三元复合物，通过空间位阻抑制细胞壁合成并扰乱膜蛋白定位；又可直接与阴离子磷脂相互作用引发去极化。这种双机制模型合理解释了达托霉素难以产生高水平耐药的原因——细菌需同时规避两种杀伤压力，且静止期细胞无法通过休眠逃避膜去极化作用。该研究不仅解决了长达数十年的机制争议，更为开发针对细胞壁前体脂质的新一代抗生素（如teixobactin、clovibactin）提供了新型L-形式筛选模型，对应对多重耐药革兰阳性菌感染具有重要临床指导意义。