LptDEMY全复合物结构揭示脂多糖外膜转运的构象开关机制

《Nature Communications》：Structural basis of lipopolysaccharide assembly by the outer membrane translocon holo-complex

本研究针对革兰氏阴性菌外膜脂多糖（LPS）转运机制不明确的难题，通过解析LPS转运体LptDEMY全复合物的冷冻电镜结构，结合功能实验和分子动力学模拟，首次发现LptD通过β-发夹/β-桶界面在收缩态与伸展态间的构象转换介导LPS跨膜转运。该研究阐明了脂蛋白LptM和LptY在稳定转运体结构和促进侧向门开启中的协同作用，为针对Lpt途径的新型抗生素设计提供了结构基础。

　　

在细菌与人类的永恒博弈中，革兰氏阴性菌凭借其独特的外膜（Outer Membrane, OM）构筑起坚固的防线。这层膜的非对称结构是其强大防御力的关键：内层由磷脂组成，而暴露于外界的外层则密布着脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）。LPS分子通过其带负电的磷酸基团和脂质A的疏水尾部，在外膜中形成一道几乎不可穿透的屏障，使细菌能够抵抗宿主免疫攻击和多种抗生素的侵袭。然而，一个根本性问题长期困扰着科学家：体积庞大且高度亲水的LPS，是如何从细胞内部被精准地“安装”到外膜的外侧叶，而不混入内侧叶的？这个关键任务由被称为Lpt（Lipopolysaccharide transport）途径的蛋白质机器执行。其中，位于外膜的LptD-E转运体是LPS旅程的终点站，其功能至关重要，但其工作机制，尤其是LPS如何穿过LptD的β-桶（β-barrel）结构并插入膜中的分子细节，一直是个未解之谜。

此前的研究表明，LptD是一个包含26条β-链的跨膜β-桶蛋白，其内部部分被脂蛋白LptE占据。LPS被认为通过LptD的β-发夹（β-taco）结构域接收，然后需要穿过LptD的β-桶，并通过其β1与β26链之间一个假想的侧向门（lateral gate）释放到外膜中。然而，所有已知的高分辨率结构都捕获到LptD侧向门处于关闭状态，其开启机制以及LPS转运的选择性始终不清。近期研究发现，一个名为LptM的脂蛋白与LptD的折叠和氧化成熟有关，但它是否以及如何参与LPS转运仍是未知数。本研究正是在此背景下，旨在深入揭示外膜LPS转运体的完整组成、精细结构和工作原理。

研究人员综合运用了单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）技术解析了LPS转运体多种复合物（包括核心复合物LptDE、亚复合物LptDEM、LptDEY以及全复合物LptDEMY）的高分辨率结构。通过功能缺失和回补实验、位点特异性光交联、二硫键交联分析以及氢氘交换质谱（HDX-MS）等技术，评估了LptM和LptY的生物学功能。进一步利用分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟，在包含LPS的不对称脂质双分子层中模拟了不同复合物的动态行为，以探究侧向门的开合动力学。研究还涉及了系统发育学分析以确定新蛋白的保守性，并使用基于质谱的蛋白质组学方法鉴定复合物组分。

LptY被鉴定为LPS转运体的新组分

在纯化LptDE和LptDEM复合物时，研究人员意外地发现了一个约15 kDa的额外蛋白条带。通过质谱分析，该蛋白被鉴定为YedD，一个外膜脂蛋白。鉴于其与Lpt途径的关联，研究者将其命名为LptY。系统发育分析显示，lptY与lptM类似，在肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和欧文氏菌科（Erwiniaceae）中保守存在。 native MS和下拉实验证实LptY能与LptDE稳定结合，形成化学计量比为1:1:1:1的LptDEMY全复合物。这表明LptY是LPS转运体的一个固有组分。

LPS转运体全复合物及亚复合物的结构解析

利用冷冻电镜，研究团队成功解析了LptDE（2.74 ?）、LptDEM（2.47 ?）、LptDEY（2.62 ?）和LptDEMY全复合物（2.63 ?）的结构。在核心LptDE复合物结构中，LptD的β-发夹结构域由于构象柔性而无法被观测到。而LptM或LptY的结合，如同“分子脚手架”般，稳定了β-发夹结构域，使其结构得以被解析。这些结构为理解各个组件的相互作用奠定了基础。

LptM与LptD侧向门的相互作用

结构分析揭示，LptM的N端片段（LptM_20-29）插入LptD的β-桶内部，与β1-β4附近的残基以及β-发夹/β-桶铰链区广泛接触。尤为重要的是，LptM的一个酰基尾部甚至插入了β1和β26链朝向膜外侧的侧面之间。LptM被“禁锢”在连接β-发夹与β-桶的两对二硫键（C1-C3, C2-C4）和膜内叶之间，其定位提示它在LptD于BAM复合物上组装时便已介入。

LptY独立于LptM与LptDβ-发夹结构域相互作用

LptY呈现出类似脂钙蛋白（lipocalin）的8链β-桶折叠。它结合在LptD的β-发夹结构域的外表面，靠近其N端α-螺旋。功能实验表明，LptY的缺失本身不影响LptD的氧化成熟，但在缺乏二硫键氧化酶DsbA的背景下，ΔlptY会加剧外膜通透性缺陷。此外，当Lpt桥（Lpt bridge）因LptC过表达而受到干扰时，同时缺失lptM和lptY的菌株对胆汁盐更为敏感，并伴有LPS修饰，表明LptM和LptY共同保障了Lpt途径的运行效率。

LptD通过其β-发夹/β-桶界面的收缩与伸展发挥作用

结构比对发现了LptD存在两种截然不同的构象状态。在同时结合LptM和LptY的全复合物（LptDEMY）或仅结合LptM的复合物（LptDEM）中，LptD处于“伸展态”（extended state）。而在仅结合LptY的LptDEY复合物中，LptD呈现出一种新的“收缩态”（contracted state）。在收缩态下，β1链沿着β26链向周质侧滑动了约2个氨基酸残基的位置，导致β-桶的剪切数（shear number）增加。同时，连接β-发夹与β1的铰链环向β-桶腔内弯曲，使得β-发夹结构域更靠近膜，两个结构域之间的间隙（以P219和N232之间的距离衡量）从伸展态的19.7 ?缩小到收缩态的12.0 ?。两个保守的脯氨酸残基（P231和P246）在此构象转换中充当了枢轴点。

收缩态下LptD侧向门的开启对其功能至关重要

为了验证收缩态是否具有生理相关性，研究人员构建了在β1和β26上引入半胱氨酸对的LptD突变体。当用氧化剂4,4-二吡啶二硫醚（4-DPS）处理时，能够形成模拟收缩态配对方式的二硫键（如N232C/E757C）的菌株生长受到严重抑制，而β1与β2之间的二硫键锁定则不影响生长。这表明在体内，LptD的侧向门能够呈现收缩态构象，并且其开启（防止被二硫键锁定）对于功能至关重要。

LptM诱导门控动力学，促进β1-β26链分离

分子动力学模拟显示，LptM的存在显著增强了LptD侧向门的动态性。在含有LptM的模拟中，β1与β26之间的氢键数量减少，波动性增大，甚至在部分模拟中观察到了β1与β26的完全分离。将Kdo₂-脂质A（KLA）模型构建到β-发夹结构域中后，这种链分离的趋势更加明显。相反，LptY对侧向门动力学影响较小。这些结果表明LptM是侧向门动态波动和有效开启的关键促进者。

LptM在LPS门控过程中作用于转运体

位点特异性光交联实验发现，LPS能与LptD的β-发夹结构域以及β1链顶端（如T236位点）和β1-β2环（如N239位点）高效交联。β1链顶端是构象转换中位移最大的区域，也是LPS结合的主要位点。特别值得注意的是，在缺乏LptM的情况下，T236位点与LPS的交联效率急剧下降超过90%。然而，当同时拉取LptM和LPS时，发现LPS仍能在LptM存在的情况下结合到LptD的236位点。这表明LPS在转运过程中能够绕过LptM，而LptM的作用是促进LPS接近和通过侧向门。

本研究通过整合结构生物学、生物化学和计算生物学方法，揭示了LPS外膜转运体LptDEMY的全复合物结构及其新颖的工作机制。最重要的发现是LptD存在收缩与伸展两种构象状态，并通过其β1链的“划动”来推动LPS向外膜外叶转运。LptM和LptY作为关键的调控因子，分别通过促进侧向门动态开启和稳定β-发夹结构域来协同优化转运效率。

该研究的意义重大而深远。首先，它解决了革兰氏阴性菌生物膜学中的一个长期悬而未决的核心问题，为理解LPS这种巨大且复杂的分子如何被精确组装到外膜提供了详细的分子框架。其次，研究揭示的LptD构象开关机制，为开发针对Lpt途径的新型抗生素提供了前所未有的精准靶点。LptM和LptY在致病性肠杆菌科和欧文氏菌科中高度保守，针对这些辅助蛋白或其与LptD相互作用界面的药物设计，有望克服现有抗生素的耐药性，创造出能够破解细菌外膜屏障的全新武器。总之，这项研究不仅深化了我们对细菌基本生命过程的理解，也为应对日益严峻的抗生素耐药性挑战开辟了新的战略方向。