《Nature Communications》：Single-cell genomics reveals complex microbial and viral associations in ciliates and testate amoebae
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为破解“不可培养”原生生物的微生物组暗箱，作者团队首次对104个野外纤毛虫和有壳变形虫进行单细胞基因组与转录组测序，回收724个MAG、81个GVMAG及33条virophage序列，发现117个已知内共生菌和258个Patescibacteriota新支系，并证实巨型病毒在宿主体内活跃转录，提出“原生生物是多生物互作枢纽”的新生态范式，为追踪病原体起源与营养循环机制提供基因组蓝图。
在淡水沼泽与潮间带沙粒间，生活着一类肉眼难辨的“微型动物园”——纤毛虫和有壳变形虫。它们吞噬细菌、矿化养分，是生态系统的隐形工程师。然而，由于绝大多数种类尚无法人工培养，其体内复杂的微生物“房客”与病毒“入侵者”长期隐藏在黑箱之中：它们究竟与宿主形成何种共生或寄生关系？是否暗藏未来可能跃迁到人畜的病原体“训练营”？为回答这些悬而未决的问题，Schulz等学者对采自酸性泥炭沼、低pH池塘及海滨沙粒的104个单细胞原生生物，开展了迄今最大规模的培养非依赖单细胞多组学调查，相关成果发表于《Nature Communications》。
作者首先用显微手挑与洗涤策略获得单个细胞，以Repli-g单细胞试剂盒进行全基因组扩增（WGA），并用SMART-Seq v4进行转录组扩增，随后在高通量Illumina平台完成10–80 M读长双端测序；利用SPAdes进行单细胞组装后，采用MetaBat2基于四核苷酸频率完成宏基因组分箱，结合CheckM2及GTDB-tk对724个原核MAG进行质量评估与物种注释；病毒序列则通过geNomad与CheckV识别，并用gvclass及iPHoP对81个≥50 kb的巨型病毒MAG和33条virophage进行系统分类与宿主预测；最后通过单细胞转录本比对，确认病毒基因在宿主体内是否活跃表达。
研究结果分四部分展开：
原生生物微生物组的组成与多样性
通过比较104个SAG，发现纤毛虫与变形菌的微生物组结构显著不同；同为有壳变形虫的Hyalosphenia elegans每Gb序列可回收53个MAG，而其近缘种H. papilio仅11个，提示宿主细胞大小及是否存在藻类内共生体显著影响细菌载荷。共获得16门、>140属的细菌/古菌，表明即便在单细胞尺度，原生生物亦可承载极高α-多样性。
已知与潜在新内共生菌的广泛分布
117个MAG归属于已报道的动物-原生生物内共生支系，包括Holosporales、Rickettsiales、Legionellales、Chlamydiota及新门Babelota；其中α-变形菌仅见于纤毛虫，而Francisellaceae、Diplorickettsia等则特异性与有壳变形虫结合。值得注意的是，56个Chlamydiota MAG分属5个科水平新支系，提示该门在原生生物体内正经历剧烈辐射演化。
Patescibacteriota构成庞大但功能模糊的“暗物质”
共回收258个Patescibacteriota MAG，占总体近36%，其基因组普遍<1 Mb，富含穿孔酶、磷脂酶及转运蛋白，符合胞内寄生或共生特征；然而共现网络缺乏宿主特异性，仍需荧光原位杂交等实验验证其是否真正生活于宿主胞内。
巨型病毒与virophage的活跃共感染
81个GVMAG隶属Nucleocytoviricota六大目，其中Imitervirales、Pimascovirales等科的转录本在H. elegans、Loxodes等细胞中被检出，首次直接提示巨型病毒可能在纤毛虫体内完成转录周期。27条virophage序列与巨型病毒共现，但未见整合到宿主染色体，亦未在转录组中检测到表达，暗示其处于潜伏或病毒-病毒互作状态。
功能基因组比较显示，已知内共生菌和Patescibacteriota的代谢模块完整性显著低于自由生菌，且广泛携带毒素-抗毒素（TA）系统，可能用于维持宿主内长期共存；与参考菌“Candidatus Azoamicus ciliaticola”相比，自Loxodes获得的UBA6186支系MAG缺失反硝化基因簇，但保留细胞色素bd、o氧化酶及苹果酸酶途径，提示其适应微好氧胞内环境并可通过脯氨酸降解为宿主提供ATP/还原力。
研究结论与讨论指出，单细胞基因组学首次系统证实“不可培养”纤毛虫与有壳变形虫是细菌内共生体、巨型病毒、virophage及藻类的多生物互作热点；不同宿主分类单元与采样生境共同塑造微生物组的独特性与丰富度，而宿主细胞大小、形态及生活方式仅发挥中等作用。该发现不仅拓展了对原生生物生态功能的认识，也为解析人类病原体（如Chlamydiaceae、Legionellales）的进化起源提供了新的“原生生物训练营”假说的基因组证据，同时提示巨型病毒可能利用纤毛虫作为替代宿主完成生命周期。未来需结合培养、成像及基因编辑，进一步验证共生关系方向与生态健康效应。
