人源PKM2修饰mRNA心肌特异性过表达促进猪心脏梗死后再生与功能恢复

《Nature Communications》：Transient overexpression of hPKM2 in porcine cardiomyocytes prevents heart failure after myocardial infarction

本研究针对心肌梗死后心力衰竭防治难题，开发了心肌细胞特异性修饰mRNA递送系统(CM SMRTs)，通过瞬时表达人源丙酮酸激酶M2(hPKM2)，在猪缺血再灌注模型中成功诱导心肌细胞增殖、血管新生和功能恢复。该疗法在幼年和成年猪模型中均显著改善射血分数(EF)达22.5%，减少瘢痕形成，且不引发心律失常，为临床心脏再生治疗开辟了新途径。

　　

当心脏遭遇心肌梗死时，死亡的心肌细胞会被纤维疤痕取代，导致心脏功能不可逆下降，最终发展为心力衰竭——这个全球主要死亡原因至今缺乏有效治疗方法。虽然组织工程、细胞治疗和基因治疗等策略不断涌现，但临床转化进展缓慢。特别是成年哺乳动物心肌细胞几乎丧失增殖能力，如何安全有效地重新激活这种能力成为再生医学领域的重大挑战。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，科学家们开发了一种创新性的治疗策略：利用心肌细胞特异性修饰mRNA翻译系统(CM SMRTs)，在猪心脏中瞬时过表达人源丙酮酸激酶M2(hPKM2)，成功实现了心肌再生和功能恢复。这种基于修饰mRNA的技术平台曾成功应用于COVID-19疫苗，本研究将其创新性地应用于心脏再生领域，为心力衰竭治疗带来了新希望。

研究团队采用的关键技术方法包括：改良mRNA体外转录合成技术；建立幼年约克夏猪和成年辛克莱小型猪的缺血再灌注(I/R)模型；通过开胸手术进行心肌内直接注射给药；利用超声心动图和心脏磁共振成像(cMRI)进行长期心功能监测；采用免疫荧光染色分析细胞增殖、血管新生和免疫细胞浸润；并通过程序电刺激(PES)评估致心律失常风险。实验动物包括幼年约克夏猪(-35kg)和成年辛克莱小型猪(-1岁，-35kg)，随机分为治疗组和对照组。

modRNA在猪心脏中的生物分布特征

研究人员首先评估了裸modRNA在猪心脏中的分布情况。在I/R损伤一周后，向幼年约克夏猪的左心室中部注射LacZ modRNA，一周后发现LacZ阳性染色广泛分布于梗死周边区域，覆盖约30%的左心室面积，表明在梗死区域周围具有广泛的区域性转染效率。

CM SMRTs实现心肌细胞特异性表达

为验证CM SMRTs能否在猪中限制modRNA翻译仅发生在心肌细胞，研究人员比较了常规nGFP modRNA与nGFP-CM SMRTs的表达模式。结果显示，常规nGFP modRNA在cTnT+(心肌细胞)和cTnT-(非心肌细胞)中均有GFP表达，心肌细胞与非心肌细胞比值为2:1；而CM SMRTs实现了近乎排他性的心肌细胞特异性，比值达到16:1，验证了其在猪心肌中的特异性。

hPKM2介导瞬时表达

hPKM2 CM SMRTs注射后第1天，心肌细胞中观察到强烈的核hPKM2表达，持续但逐渐降低的表达在第7天和第60天无法检测到。未处理对照组的心肌细胞中无hPKM2信号，证实modRNA表达是瞬时的，但在递送后至少一周内具有治疗相关性。

hPKM2促进心肌细胞增殖

在I/R损伤一周后，分别给幼年猪注射vehicle、miR1-208 Cas6 modRNA、mPkm2 CM SMRTs或hPKM2 CM SMRTs。免疫染色显示，mPkm2和hPKM2 CM SMRTs均显著增加梗死边界区心肌细胞中Ki67和磷酸化组蛋白H3(PH3)阳性细胞数量，而对照组无此效应。远程区域这些增殖标记物无变化，表明PKM2的作用具有局部特异性。

hPKM2上调血管生成和心脏保护靶点

除促进心肌细胞周期活性外，hPKM2 CM SMRTs显著上调边界区VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、ANG1、leptin和PDGF的表达，同时选择性上调关键PKM2转录靶点HIF-1α、c-Myc和NF-κB。这些变化与PKM2翻译和持续的复杂血管生成基因反应一致，确立了PKM2作为诱导心肌再生、血管再生和心脏保护的关键调控基因。

hPKM2恢复心脏功能并减少瘢痕大小

在慢性I/R模型中，I/R损伤一周后向20只幼年约克夏猪注射hPKM2 CM SMRTs或vehicle。治疗当天(第0天)，两组心脏功能均下降(射血分数约34%)。vehicle治疗组心脏功能持续恶化，至第56天射血分数降至32.1%，短轴缩短率(FS)降至15%。相反，hPKM2组表现出进行性持续改善，射血分数增至54.1%，短轴缩短率达27.5%，接近正常心脏功能水平。所有vehicle治疗猪均符合心力衰竭伴射血分数降低(HFrEF)标准，而hPKM2治疗猪无一符合。

心脏磁共振成像证实了这些发现：hPKM2治疗组终点射血分数升至50.3%，对照组为31.7%；每搏输出量增加，收缩末期容积显著减少，舒张末期容积无变化。应变分析显示hPKM2治疗猪在中左心室(注射部位)区域室壁运动增强，径向应变(ε_rr)和左心室壁增厚(LVWT)增加。组织学分析显示hPKM2治疗猪梗死面积显著减小，尤其在中部和心尖段。晚期钆增强心脏磁共振成像(LGE-cMRI)显示hPKM2治疗心脏梗死体积和瘢痕大小显著减小，梗死核心(白区)和梗死周围区域(灰区)均减小，表明结构完整性和组织活力改善。

hPKM2促进血管新生和心肌细胞更新

注射56天后分析心脏发现，hPKM2治疗心肌中包含内皮细胞(CD31+)、平滑肌细胞(αSMA+)和周细胞(NG2+/CD31+)的管腔结构显著增多，免疫细胞浸润(CD45+)无差异，表明毛细血管更成熟且无慢性炎症增加。心肌细胞分析显示hPKM2组心肌细胞横截面积显著减小，单核心肌细胞比例增加，双核或多核心肌细胞无扩张，表明细胞更新而非肥大。第56天Ki67染色组间无差异，证实增殖反应是瞬时且受控的。程序电刺激(PES)显示持续性室性心律失常和非持续性室性心律失常频率组间相似，表明hPKM2 CM SMRTs不增加致心律失常风险。

hPKM2在成年猪中改善心脏功能

在成年辛克莱小型猪中，I/R后立即给予hPKM2 CM SMRTs治疗。损伤后28-29天，超声心动图显示hPKM2治疗猪心脏收缩性显著改善，射血分数增加16.7%，短轴缩短率增加9.7%。终点收集的心脏显示hPKM2治疗动物瘢痕显著减小。边界区组织学显示hPKM2治疗动物心肌细胞横截面积减小，单核心肌细胞比例增加。此时点(第29天)增殖标志物Ki67和PH3组间无差异，表明hPKM2诱导的细胞周期活性已消退。血管分析与幼年猪结果一致，CD31+内皮细胞、αSMA+平滑肌细胞和CD31+/NG2+周细胞的管腔结构显著增加，CD45+免疫细胞浸润无变化。

研究结论与意义

本研究证实，单次给予hPKM2 CM SMRTs可在幼年猪缺血损伤一周后诱导持续的功能和结构改善，益处持续七周，有再生证据和心功能改善。心肌细胞增殖是瞬时且受控的，无免疫激活或心律失常迹象。在成年猪I/R后单次给药观察到相似治疗模式，更准确反映临床缺血性心脏病人群。

hPKM2 CM SMRTs方法避免了其他递送方法的安全问题。与AAV(腺相关病毒)基因治疗相比，瞬时modRNA递送系统具有更强安全性。CM SMRTs平台能够在心肌细胞中靶向表达强效转录因子，而不引发免疫反应或风险DNA整合。hPKM2递送促进心肌细胞增殖，诱导心脏保护和促血管生成基因程序，导致心室壁增厚、功能改善和心力衰竭预防，且不触发心律失常。

值得注意的是，先前VEGF-A modRNA猪研究仅产生适度功能增益(射血分数改善约5%)，而本研究使用类似设计实现了四倍以上获益(22.5%)，凸显了hPKM2-CM-SMRTs用于再生性心脏修复的治疗潜力。该研究为临床转化提供了坚实证据，为心力衰竭治疗开辟了新途径。