通过低剂量多柔比星/黄酮类衍生物共载纳米盘增强肝细胞癌中GSDME诱导的焦亡作用

《Drug Delivery》：Enhancing GSDME-induced pyroptosis through low-dose doxorubicin/biflavonoid derivative co-loaded nanodisc in hepatocellular carcinoma

纳米盘协同低剂量多柔比星与新型黄酮类衍生物F24通过抑制CDK6激活p53诱导肝细胞癌焦亡和自噬，显著抑制肿瘤生长且降低毒副作用。

　　肝癌是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，是全球范围内导致癌症死亡的主要原因之一。传统治疗手段如手术、放疗和化疗虽有一定疗效，但常伴随严重的毒副作用，限制了其在临床中的应用。近年来，研究者们将目光投向了一种新型的细胞死亡方式——焦亡（pyroptosis），并发现其在抗肿瘤治疗中具有巨大潜力。焦亡是一种由gasdermin蛋白介导的程序性细胞死亡形式，其特点是细胞膜的破裂和炎症因子的释放，能够有效激活免疫反应，增强抗肿瘤效果。然而，单独使用高剂量的化疗药物如多柔比星（DOX）可能引发急性非靶向细胞毒性及全身性不良反应，因此需要探索更安全、高效的治疗策略。

本研究中，研究人员发现一种新型的双黄酮衍生物F24能够显著提高肝癌细胞对低剂量DOX的敏感性，并降低DOX的毒副作用。通过将F24与DOX共同封装在具有大疏水腔的纳米盘（nanodiscs）中，构建了一种新型的协同给药系统，命名为DF@N。该系统能够提高两种药物在肿瘤组织中的积累，并确保在细胞内的药物比例保持完整。实验结果显示，DF@N能够有效触发基于gasdermin-E（GSDME）的焦亡，同时伴随着caspase-3的切割。有趣的是，敲除GSDME或caspase-3后，DF@N诱导的细胞死亡从焦亡途径转变为凋亡途径，表明焦亡是DF@N发挥抗肿瘤作用的关键机制。此外，DF@N在Huh7小鼠异种移植瘤模型中显示出显著的抗肿瘤效果，并能够激活焦亡过程，从而为肝癌治疗提供了一种安全有效的策略。

F24通过靶向CDK6抑制药物外排，从而增加DOX在肝癌细胞内的积累，进而诱导焦亡和自噬（autophagy）。CDK6是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其在肿瘤治疗中具有重要的调控作用。研究表明，CDK6的抑制能够减少多药耐药蛋白ABCB1的表达，从而增强DOX的细胞内蓄积，提高其抗肿瘤效果。此外，F24还能激活p53蛋白，进一步促进焦亡的发生。通过分子对接模拟，研究人员发现F24与CDK6之间存在稳定的结合，其结合能为-10.825 kcal/mol，表明其具有良好的靶向性和结合能力。实验数据表明，F24与DOX的协同作用不仅提高了肝癌细胞的焦亡率，还增强了自噬效应，从而显著提升了治疗效果。

为了实现F24与DOX的协同作用，研究人员采用了一种新型的纳米给药系统——DF@N。该系统由长链磷脂（DPPC）、短链磷脂（DHPC）和磷脂-聚乙二醇（DSPE-PEG2000）组成，其独特的盘状结构使得DF@N具有更高的细胞摄取率和药物载药效率。通过透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）等技术，研究人员确认了DF@N的形态和物理化学特性，其平均粒径为21.65 ± 1.58 nm，多分散系数（PDI）为0.23 ± 0.04，且在4℃下储存14天后粒径变化不大，表明其具有良好的稳定性。此外，DF@N在不同pH值条件下的药物释放特性也得到了验证，其在pH 5.5条件下的释放速率显著高于pH 7.4，表明其具有pH响应性，有助于在肿瘤微环境中实现药物的靶向释放。

在细胞实验中，研究人员发现DF@N能够显著提高HCC细胞的焦亡和自噬水平。通过细胞活力实验和乳酸脱氢酶（LDH）释放实验，研究人员验证了DF@N对肝癌细胞的杀伤作用。荧光显微镜观察显示，DF@N处理后的肝癌细胞呈现明显的膜泡化和细胞肿胀，这些形态学特征与典型的凋亡不同，更符合焦亡的特征。此外，通过Western blot和免疫荧光分析，研究人员发现DF@N能够显著上调GSDME- N和caspase-3的表达，并促进LC3B-II的积累，同时减少p62的表达，进一步支持其诱导自噬的作用。实验还表明，DF@N能够增强细胞内的活性氧（ROS）水平，而ROS的增加与焦亡和自噬的激活密切相关。

在动物实验中，研究人员评估了DF@N在Huh7异种移植瘤小鼠模型中的体内分布和抗肿瘤效果。通过体内荧光成像技术，研究人员发现DF@N在肿瘤部位的荧光信号显著强于游离DOX或F24，表明其具有良好的肿瘤靶向能力。同时，DF@N在体内具有较长的循环时间，能够有效减少对正常组织的损伤。实验结果表明，DF@N能够显著抑制肿瘤生长，并通过焦亡和自噬的双重机制发挥抗肿瘤作用。此外，通过H&E染色和TUNEL实验，研究人员确认了DF@N在肿瘤组织中引起的细胞空泡化和染色质浓缩，进一步支持其诱导细胞死亡的机制。值得注意的是，DF@N处理后，小鼠的血清CK-MB水平显著降低，表明其能够有效减轻DOX引起的心脏毒性。

在代谢组学分析中，研究人员发现DF@N处理后的肿瘤组织中，有66种代谢物发生了显著变化，主要涉及氨基酸、脂类、碳水化合物及其衍生物。这些代谢物的变化与焦亡和自噬的激活密切相关，表明DF@N能够通过调节细胞代谢，增强其抗肿瘤效果。此外，研究人员还发现DF@N能够显著改变多种甘油磷脂的表达，包括磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酸（PA），这可能与DF@N对细胞膜结构的重塑有关。通过代谢通路富集分析，研究人员发现这些变化主要与氨基酸代谢、碳水化合物代谢、脂代谢和ABC转运体相关，进一步揭示了DF@N在调节肿瘤细胞代谢中的作用。

综上所述，DF@N作为一种基于纳米盘的协同给药系统，能够有效提高DOX和F24在肿瘤细胞内的积累，同时通过调控CDK6和p53等关键蛋白，诱导焦亡和自噬，从而显著增强其抗肿瘤效果。此外，DF@N在体内表现出良好的生物相容性和低毒性，能够有效减少对正常组织的损伤。这些发现不仅为肝癌的治疗提供了新的思路，也为开发安全有效的纳米给药系统奠定了基础。未来的研究可以进一步探索DF@N在其他类型癌症中的应用，并优化其给药方式，以期在临床中实现更广泛的应用。