四基因组合在辐照迷你猪外周血样本中用于预测H-ARS严重程度的适用性

《International Journal of Radiation Biology》：Applicability of a four-gene set for H-ARS severity prediction in peripheral blood samples of irradiated minipigs

本研究在辐照的迷你猪中验证了用于急性放射综合征（ARS）严重程度预测的四基因集合（FDXR、DDB2、POU2AF1、WNT3），但未观察到预期的基因表达模式与H-ARS严重程度的相关性，表明迷你猪不适合作为该基因集的替代验证模型。

　　急性辐射综合征（ARS）是一种由高剂量电离辐射引起的严重健康威胁，尤其在核事故或放射性武器使用等大规模伤亡场景中，其早期诊断和预测对于提高救治成功率至关重要。造血系统急性辐射综合征（H-ARS）作为ARS的一种重要亚型，主要表现为白细胞数量的急剧下降，尤其是淋巴细胞和粒细胞的减少，可能导致免疫系统功能障碍，增加感染风险，并最终引发致命后果。因此，能够通过早期生物标志物检测快速评估H-ARS严重程度的方法，对于及时采取针对性治疗具有重要意义。

近年来，研究者们通过高通量基因表达分析，发现某些基因的表达变化与H-ARS的严重程度密切相关。这些基因包括FDXR、DDB2、POU2AF1和WNT3，它们的表达模式在非人灵长类动物（NHPs）和白血病患者中已被验证可用于预测H-ARS的临床结局。本研究旨在进一步验证这一基因集合是否可以在另一种常见的动物模型——哥廷根小型猪（G?ttingen minipigs）中应用，以评估其作为H-ARS预测模型的潜力。小型猪因其与人类在解剖学、生理学和生化特性上的高度相似性，被认为是翻译医学研究中的重要模型，同时相较于灵长类动物，其成本更低、更易于大规模实验，因此具有广泛的应用前景。

在实验设计中，研究团队选取了12只哥廷根小型猪，分为两组，分别接受1.8 Gy和2.1 Gy的全身照射。1.8 Gy的剂量被认为接近于40%的死亡率（LD≈40/30），而2.1 Gy则可能导致更高的死亡率。为了评估H-ARS的严重程度，研究者采用了METREPOL标准，该标准基于外周血细胞计数的变化，将H-ARS分为四个等级：H1（轻度）、H2（中度）、H3（重度）和H4（极重度）。在人类中，H1代表没有明显症状的个体，H2则需要监测而非紧急治疗，而H3和H4则需要立即进行重症干预。

实验过程中，研究团队对小型猪的血液样本进行了采集和处理。在照射前以及照射后第1、3和10天，从每只动物的外周血液中提取样本，用于定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析。为了确保基因表达数据的准确性，研究者使用了18S rRNA和PUM1作为内参基因进行标准化处理。这些内参基因的表达水平在正常情况下保持稳定，能够帮助消除实验过程中由于个体差异或技术误差带来的干扰。

在基因表达分析方面，研究团队发现，尽管所有基因在照射后均显示出一定程度的表达变化，但与预期的H-ARS严重程度相匹配的表达模式并未出现。具体而言，FDXR和DDB2的上调以及POU2AF1和WNT3的下调，这种组合通常被用来预测H-ARS 2–4度的严重性，但在小型猪中并未观察到这种特征性变化。此外，WNT3在大多数样本中无法被检测到，这可能与其基因表达水平较低或实验方法的局限性有关。值得注意的是，WNT3的表达缺失可能与小型猪中生长激素受体（GHR）的突变有关，这种突变可能导致矮小症，并影响WNT信号通路的活性。

在临床进展方面，所有接受1.8 Gy照射的小型猪均被归类为H-ARS 2度，而接受2.1 Gy照射的小型猪则有一半被归为H-ARS 3度，另一半为H-ARS 4度。尽管淋巴细胞的数量在照射后显著下降，且在部分动物中出现了恢复趋势，但粒细胞和血小板的数量却持续减少，且在多数动物中没有恢复迹象。这表明H-ARS的严重程度可能高于基于淋巴细胞计数的评估。然而，令人意外的是，这些严重程度并未与预期的基因表达变化相吻合，说明小型猪在基因表达层面可能与人类的反应存在差异。

在内参基因的稳定性方面，研究发现18S rRNA的表达变化显著高于PUM1。这种高变异性的表现可能与样本处理过程中的某些因素有关，例如实验前的细菌感染或其他生理状态的波动。因此，研究团队决定采用PUM1作为标准化内参基因，以减少由于18S rRNA的不稳定性带来的误差。这种调整使得后续的基因表达分析更加可靠，同时也为后续研究提供了更准确的比较基础。

在基因表达变化的统计分析中，研究团队采用配对t检验来评估不同时间点的基因表达差异。结果显示，尽管FDXR、DDB2和POU2AF1在照射后表现出一定的上调趋势，但这种变化并未达到预期的显著水平。此外，对于POU2AF1的下调，仅在照射后的第一天观察到部分动物的表达下降，而后续时间点的变化并不明显。这表明，小型猪在基因表达层面的反应可能与人类或其他灵长类动物存在显著差异，尤其是在H-ARS的早期阶段。

值得注意的是，研究团队在实验过程中还观察到一些与人类反应不同的现象。例如，在照射后的前48小时内，小型猪并未表现出预期的前驱症状，如呕吐和腹泻，而这些症状通常被认为是ARS早期阶段的重要标志。尽管这些症状在部分死亡的小型猪中被观察到，但它们的出现时间较晚，可能与小型猪对辐射的反应机制不同有关。此外，血小板的持续下降也表明H-ARS的严重程度可能更高，但这并未与基因表达的变化相匹配。

本研究的结果表明，尽管哥廷根小型猪在某些生理和生化特性上与人类相似，但在基因表达层面，它们并不能作为H-ARS严重程度预测的合适模型。这可能意味着，该基因集合在人类和灵长类动物中的有效性并不能直接推广到小型猪。然而，这一结论并不否定小型猪在其他方面的研究价值，例如药物开发或放射生物学的其他领域。研究团队指出，未来需要更多的实验数据来进一步验证这一结论，并探索小型猪在H-ARS研究中的其他潜在应用。

此外，研究团队还提到本研究存在一些局限性，包括样本数量较少以及仅使用了两种剂量。虽然这些剂量有助于评估不同严重程度的H-ARS，但为了更全面地理解基因表达与H-ARS严重程度之间的关系，未来的研究需要增加样本量，并考虑不同性别之间的差异。由于本研究的样本量较小，性别差异的分析未能进行，但初步数据并未显示明显的性别相关性。

综上所述，本研究为H-ARS的早期诊断和预测提供了新的视角，同时也揭示了哥廷根小型猪作为模型动物的局限性。尽管基因表达模式在人类和灵长类动物中已被验证，但在小型猪中并未出现预期的变化。这一发现强调了在选择动物模型时，必须充分考虑其与人类反应机制的相似性，并结合具体的实验设计和分析方法，以确保研究结果的准确性和适用性。未来的研究可以结合多种动物模型，进一步探索H-ARS的分子机制，并开发更加精准的生物标志物，以提高早期诊断和治疗的效率。