用于协同治疗碳青霉烯类耐药中枢神经系统感染的BBB-穿越型可电离上转换纳米颗粒

《Research》：BBB-Crossing Ionizable Upconversion Nanoparticles for Synergistic Therapy of Carbapenem-Resistant Central Nervous System Infection

pH/NIR双响应纳米系统UC@MOF@RB+MEM通过协同光动力疗法与抗生素释放，有效穿透血脑屏障并抑制产碳青霉烯酶肠杆菌生物膜，同时Zn2+释放减轻神经炎症，显著改善小鼠中枢神经系统感染疗效。

　　这项研究聚焦于治疗由耐碳青霉烯类肠杆菌（CRE）生物膜引发的中枢神经系统（CNS）感染这一重大医疗挑战。由于抗生素耐药性的上升以及血脑屏障（BBB）的限制性，这些感染的治疗变得尤为困难。为此，研究人员开发了一种创新的pH响应型纳米治疗平台——UC@MOF@RB+MEM，它结合了上转换纳米颗粒（UCNPs）、金属-有机框架（MOF）、光敏剂玫瑰苯胺（RB）和抗生素美罗培南（MEM）。该设计不仅对pH和近红外（NIR）光具有双重响应特性，还能通过协同效应破坏生物膜并消灭细菌，同时减轻神经炎症。在CNS感染期间，BBB的通透性增加，使得可离子化的UC@MOF@RB+MEM纳米颗粒能够穿越BBB，精准地靶向感染部位。在感染区域的酸性微环境中，这些纳米颗粒释放MEM、RB和锌离子（Zn2?）。在980纳米NIR光照射下，RB产生活性氧（ROS），有效破坏生物膜和细菌膜，同时抑制碳青霉烯酶活性。ROS与MEM的协同作用使得对CRE生物膜相关细菌的快速有效清除成为可能。同时，释放的Zn2?通过抗炎和抗氧化作用减轻神经细胞损伤，从而显著提升了UC@MOF@RB+MEM在小鼠模型中治疗CNS感染的疗效。该研究提出了一种创新的策略，以克服美罗培南的耐药性，为管理CNS感染提供了有前景的解决方案，并拓展了其在其他难以治疗的耐药感染中的应用潜力。

治疗CRE感染的核心挑战之一是生物膜的形成。生物膜的密集结构由多糖、蛋白质和核酸组成，这使得抗生素难以穿透，同时让细菌能够长期存活并发展出更强的耐药性。在生物膜中，细菌的耐药性比游离细菌高出10到1000倍。因此，有效的治疗策略必须能够破坏生物膜结构并清除嵌入其中的细菌。纳米载体在靶向药物输送方面表现出高效的性能，近年来被广泛应用于癌症治疗和耐药细菌感染的管理。光动力疗法（PDT）作为一种非侵入性治疗手段，具有较低的系统毒性和较少的耐药风险，它通过光激活的光敏剂生成ROS，从而对多重耐药病原体产生杀菌效果。ROS能够增强某些抗生素对耐药细菌的杀菌能力，因此，将PDT与抗生素结合成为一种具有前景的治疗策略。研究人员提出了一种时空调控的纳米系统，用于同时输送光敏剂和抗生素，旨在通过ROS增强的抗菌作用与刺激响应的药物释放协同作用，对抗CRE生物膜相关的CNS感染。

CNS感染的微环境与正常组织存在显著差异，其中最显著的特征之一是酸性微环境的形成。这种酸性环境通常由乳酸、丙酮酸和二氧化碳等异常积累导致。目前，pH响应型纳米颗粒被开发为一种极具前景的治疗策略。这些纳米颗粒通过在酸性环境中实现靶向药物释放，从而提升治疗效率和效果。该研究中，开发的pH响应型光动力纳米系统与抗生素治疗相结合，为治疗各种类型的感染，包括CNS感染，提供了新的思路。

研究人员制备了UC@MOF@RB+MEM纳米药物，其核心为UCNPs，表面包覆有多孔ZIF-8涂层，能够吸附光敏剂RB和抗生素MEM。ZIF-8涂层通过锌乙酸盐和2-甲基咪唑的矿物化形成，其在酸性条件下会因质子化而获得正电荷，从而增强穿越BBB的能力。此外，ZIF-8的pH响应特性能够控制RB、MEM和Zn2?的最优释放，使其在感染部位发挥作用。在980纳米NIR光照射下，UCNPs激活RB，生成单线态氧用于PDT。研究结果表明，PDT能够破坏生物膜结构和细菌膜，同时降低碳青霉烯酶活性，从而提高MEM进入细胞的效率，实现对细菌的快速清除。同时，释放的Zn2?通过降低炎症和氧化应激，防止神经细胞损伤，最终达到有效的治疗效果。该研究提出的这种综合策略，为克服美罗培南耐药性提供了创新性的解决方案，并具有在后抗生素时代的临床应用前景。

为了验证UC@MOF@RB+MEM穿越BBB的能力，研究人员进一步探讨了其在体外和体内的作用机制。纳米材料穿越BBB的关键因素之一是其尺寸。10到100纳米范围内的纳米颗粒在穿越BBB的同时，能够减少快速的肾脏清除。UC@MOF@RB+MEM的平均尺寸约为50纳米，处于这一理想范围内。另一个关键参数是表面电荷。BBB内皮细胞由于富含蛋白聚糖，通常带有负电荷。UC@MOF@RB+MEM的zeta电位为+33.1毫伏，表明其具有高阳离子电荷密度，这有助于其与BBB内皮细胞的负电荷膜产生静电相互作用，从而增强吸附和运输到大脑的能力。

在CNS感染期间，BBB的通透性增加，这显著提升了UC@MOF@RB+MEM穿越脑组织的效率。神经炎症过程中，炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL-1β会降低血管内皮细胞间紧密连接蛋白的表达，从而增加BBB的通透性。实验结果显示，当细胞在CREC存在的情况下培养时，UC@MOF@RB+MEM的渗透率显著提高。在2小时时，只有14.1%的纳米颗粒被检测到，但在8小时时，这一比例增加到40.5%。当细胞与CREC共培养时，8小时时的渗透率进一步上升至55.1%。通过尾静脉注射UC@MOF@RB+MEM，并利用活体成像技术监测其在感染和非感染小鼠中的分布情况，结果表明，感染小鼠在1小时后显示出显著的纳米颗粒积累，而健康小鼠则没有明显变化。纳米颗粒在12小时内被大部分清除，但感染小鼠的脑组织中仍能观察到明显的信号。同时，在其他器官中，纳米颗粒的信号在1小时后逐渐减弱。此外，通过在纳米颗粒中加入吲哚菁绿（ICG），可以追踪其在脑组织中的分布情况。结果显示，ICG@BCNPs在感染小鼠的脑部炎症病变中表现出更强的信号，随后随着纳米颗粒的清除，信号逐渐减弱。这些结果表明，UC@MOF@RB+MEM能够有效穿越BBB，并靶向感染部位，展现出其在治疗CNS感染中的潜力。

ROS在对抗多重耐药细菌方面具有重要作用，能够破坏细菌细胞膜和生物膜，增强药物穿透生物膜的能力，从而更有效地作用于嵌入其中的细菌。在本研究中，通过将ROS与MEM结合，研究人员实现了对CREC的快速有效清除。实验结果显示，ROS与MEM的协同作用比单独使用任一成分更能显著降低细菌存活率。此外，ROS的产生还能够降低细菌对碳青霉烯酶的耐受性，从而增强MEM的杀菌效果。在体内实验中，研究发现，与对照组相比，UC@MOF@RB+MEM治疗组的细菌存活率显著降低。同时，通过使用N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为ROS抑制剂，发现其能够显著增加细菌的存活率，这进一步验证了ROS在杀菌过程中的关键作用。

UC@MOF@RB+MEM在体外和体内的抗菌和抗生物膜效果得到了验证。在体外实验中，研究人员使用不同的pH条件评估了其抗菌活性。结果显示，在中性条件下（pH 7.4），UC@MOF@RB+MEM对CREC没有明显的杀菌效果。然而，随着pH的降低，其杀菌效果逐渐增强，特别是在pH 6.8和6.2时，表现出显著的杀菌能力。此外，在pH 6.8的条件下，当进一步暴露于980纳米NIR光时，其杀菌效果显著增强。在体内实验中，研究人员建立了CNS感染的小鼠模型，并评估了UC@MOF@RB+MEM的治疗效果。结果显示，与PBS、MEM和UC@MOF相比，UC@MOF@RB+MEM治疗组的存活率显著提高，达到88.9%。同时，MRI显示，感染小鼠的脑组织肿胀和水肿情况得到了明显改善，而UC@MOF@RB+MEM治疗组的水肿面积显著减少。此外，通过超声波成像评估了脑血管密度，结果显示，与PBS组相比，UC@MOF@RB+MEM治疗组的血管密度显著增加，特别是在感染区域的皮层和丘脑中。同时，对脑组织中的细菌载量进行定量分析，发现UC@MOF@RB+MEM治疗组的细菌载量显著降低。免疫组织化学分析显示，MEM治疗组仍存在严重的微血管出血，而UC@MOF@RB+MEM治疗组的病理损伤明显减轻。此外，行为评估结果显示，UC@MOF@RB+MEM治疗组的神经功能恢复良好，表现出与健康小鼠相似的活动模式。这些结果进一步验证了UC@MOF@RB+MEM在治疗CNS感染中的有效性和安全性。

为了进一步探索UC@MOF@RB+MEM的神经保护机制，研究人员通过转录组分析评估了其对炎症因子和氧化应激的影响。结果表明，UC@MOF@RB+MEM能够显著抑制炎症相关基因的表达，如IL-1β和IL-6，并减少这些炎症因子的水平。同时，UC@MOF@RB+MEM能够提升抗氧化酶的活性，如超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT），并降低氧化应激标志物如丙二醛（MDA）的水平。这些发现表明，Zn2?在UC@MOF@RB+MEM中起到了抗炎和抗氧化的作用，从而保护神经细胞免受感染的伤害。此外，通过免疫组织化学分析，研究人员发现，UC@MOF@RB+MEM治疗组的脑组织中，神经完整性标志物NueN的表达保持稳定，而小胶质细胞和星形胶质细胞的激活水平与对照组相似，表明该治疗策略并未引起神经退行性病变或神经炎症。

在安全性方面，UC@MOF@RB+MEM表现出良好的生物相容性和低毒性。通过溶血实验，研究人员发现，即使在0.5毫克/毫升的浓度下，其对红细胞的溶血率仍低于5%，表明其具有良好的血液相容性。细胞代谢活性实验显示，UC@MOF@RB+MEM对bEnd.3和SH-SY5Y细胞的存活率超过95%，即使在980纳米NIR光照射下，其对神经细胞的毒性也极低。此外，在体内实验中，不同剂量的UC@MOF@RB+MEM（0、80、160和320毫克/千克）对小鼠的健康状况无明显影响，其对肝脏、心脏和肾脏功能的指标均在生理范围内。组织学检查显示，主要器官未出现显著的结构损伤或病理变化，进一步证明了UC@MOF@RB+MEM的安全性。

该研究通过系统的合成、表征和性能评估，展示了UC@MOF@RB+MEM在治疗CNS感染中的潜力。纳米药物的设计结合了pH响应性和NIR光激活特性，实现了对感染部位的精准定位和时空可控的药物释放。其抗菌和抗生物膜效果得到了体外和体内实验的验证，同时，其神经保护作用也通过抗炎和抗氧化机制得到阐明。此外，该研究还通过转录组分析揭示了其作用的分子机制，为治疗CNS感染提供了新的策略和理论依据。整体而言，UC@MOF@RB+MEM作为一种创新的纳米治疗平台，不仅能够有效对抗耐药性细菌，还能减轻感染引起的神经损伤，展现出在后抗生素时代管理CNS感染的广阔前景。