逐步诊断策略：结合长读长测序技术解读肌营养不良症中的表型-基因型不一致性

《The Application of Clinical Genetics》：Stepwise Diagnostic Strategy Integrating Long-Read Sequencing for the Interpretation of Phenotype-Genotype Discordance in Dystrophinopathy

肌营养不良症病例中，患者存在DMD基因内含子50-51移码缺失（通常导致Becker型），但表现为Duchenne型严重表型。通过肌肉活检发现 dystrophin-N 和-C 蛋白缺失，mRNA分析揭示新发97kb大缺失导致异常剪接，产生提前终止密码子。长读测序确认该大缺失，结合splicing预测分析，阐明读框规则例外机制。

　　本研究聚焦于一项罕见的肌营养不良症病例，揭示了基因组变异与临床表型之间的不一致性。患者为一名7.7岁的男孩，表现出严重的杜兴肌营养不良症（DMD）特征，但初步的基因检测仅发现了DMD基因中 exon 50–51 的框内缺失，这通常与贝克尔肌营养不良症（BMD）相关。这一现象挑战了传统的“阅读框规则”，即认为框内缺失的基因变异会导致部分功能的 dystrophin 蛋白产生，从而呈现较轻的临床表型，而框外缺失则会导致 dystrophin 蛋白完全缺失或极低水平的表达，进而引发严重的疾病表现。

在遗传学研究中，DMD 是一种由 X 染色体上的 DMD 基因突变引起的疾病，属于 X 连锁隐性遗传。该基因编码的 dystrophin 蛋白在维持肌肉细胞膜完整性方面发挥关键作用。当 dystrophin 蛋白缺失或功能异常时，会导致肌肉组织逐渐退化，最终引发肌无力和运动功能障碍。然而，DMD 基因的结构复杂，使其成为遗传学研究中的一个重要挑战。常见的变异形式包括基因内部的缺失或重复，而这些变异的分布和大小往往与疾病的严重程度密切相关。例如，通常认为，较大的缺失或重复更可能导致严重的疾病表现，而较小的变异可能影响较轻。

传统的“阅读框规则”认为，只要基因变异不影响开放阅读框（ORF），就能产生部分功能的 dystrophin 蛋白，从而导致较轻的表型。然而，这一规则并非绝对适用。本研究中的患者就提供了一个典型的例外案例。尽管初步的基因检测显示其 DMD 基因中 exon 50–51 的缺失是框内变异，但由于该变异引发了异常的剪接机制，最终导致了 dystrophin 蛋白的完全缺失，从而表现出典型的 DMD 表型。这表明，在评估基因变异对疾病的影响时，仅依赖于基因组层面的分析是不够的，还需要结合转录和翻译层面的详细研究。

在诊断过程中，我们采用了一种分步骤的分子分析策略，以揭示这一病例的分子机制。首先，通过肌肉活检获取组织样本，并进行组织学和分子分析。结果显示，患者的肌肉组织呈现典型的 dystrophinopathy 病理特征，包括肌纤维直径的不均匀性、结缔组织在内肌膜和束膜中的沉积，以及肌肉退化和再生的迹象。进一步的免疫组织化学分析表明，患者体内 dystrophin 蛋白的表达完全缺失，这为疾病的分子诊断提供了关键证据。

接下来，我们对肌肉组织中的 mRNA 进行了全长度分析。结果显示，患者存在两个异常的剪接产物，它们比正常 mRNA 短，并且均未保持开放阅读框。其中一个剪接产物表现为 exon 50–52 的跳过，导致 dystrophin 蛋白的提前终止；另一个则涉及 exon 50–51 的跳过，以及 exon 52 的部分缺失，同时伴有 intron 49 的部分包含。这些异常剪接事件最终导致 dystrophin 蛋白的完全缺失或严重降低，解释了患者为何表现出严重的 DMD 表型。

为了进一步确认这些异常剪接事件的分子基础，我们进行了长读长测序（long-read sequencing）分析。该方法能够更精确地检测基因组中的复杂变异，包括大范围的缺失或重复。结果显示，患者 DMD 基因中存在一个前所未有的约97kb的缺失变异，这一变异被证实是导致异常剪接的关键原因。该变异并未在已知的基因变异数据库中出现，也未在相关文献中被报道，因此具有重要的研究价值。

通过使用 Human Splicing Finder 和 Maximum Entropy Scan 等计算工具，我们进一步验证了该变异如何影响剪接过程。结果显示，这一变异在 DMD 基因的 intron 49 中引入了一个新的受体剪接位点（acceptor splice site），从而导致部分 intron 的异常包含。这一机制与传统的“阅读框规则”不同，因为它并未通过维持开放阅读框来减少疾病严重性，而是通过引入提前终止密码子（premature stop codon）导致 dystrophin 蛋白的完全缺失，从而引发严重的临床表现。

这一案例不仅挑战了传统的阅读框规则，也强调了在诊断 dystrophinopathy 时，采用分步骤的分子分析策略的重要性。首先，通过基因检测识别出可能的变异，但若发现表型与基因型不符，应进一步通过肌肉活检进行蛋白水平的确认。随后，对肌肉组织中的 mRNA 进行详细分析，以检测剪接异常。最后，利用长读长测序技术，对基因组变异进行精确的鉴定和验证。这种分步骤的策略能够有效解决基因型与表型之间的不一致问题，从而实现更精准的分子诊断。

在当前的临床实践中，尽管分子检测技术已经取得了显著进展，但许多情况下仍需依赖于肌肉活检。这是因为，某些基因变异可能在基因组层面看似无害，但在转录和翻译过程中却表现出明显的病理效应。例如，本案例中的缺失变异虽然在基因组层面属于框内变异，但由于其对剪接过程的干扰，最终导致 dystrophin 蛋白的完全缺失。因此，仅通过基因组层面的检测可能无法准确预测疾病的严重程度，必须结合转录和翻译层面的分析。

此外，这一案例也揭示了当前遗传学检测技术的一些局限性。尽管常规的 MLPA 和全外显子测序（WES）能够检测大多数 DMD 基因的变异，但仍有部分病例无法被准确识别。例如，本案例中的缺失变异可能在常规的短读长测序中被忽略，因为其长度和结构较为复杂。因此，在面对复杂的遗传病例时，采用更先进的长读长测序技术显得尤为重要。这种技术能够提供更完整的基因组序列信息，从而更准确地识别大范围的变异，特别是那些涉及剪接调控的复杂变异。

同时，这一案例也对临床实践中的基因检测策略提出了新的思考。传统上，基因检测的流程通常是先进行 MLPA 检测，以识别大范围的缺失或重复，然后再通过短读长测序检测小范围的变异。然而，本案例表明，某些复杂的基因变异可能需要直接进行长读长测序，以避免遗漏关键的分子机制。虽然长读长测序技术在临床应用中可能面临成本和可及性的问题，但其在解析复杂基因变异中的优势不容忽视。

在遗传咨询方面，这一案例也具有重要的意义。由于 DMD 是一种 X 连锁隐性遗传病，因此家族中的女性携带者可能需要接受详细的遗传咨询。然而，当基因检测结果与临床表型不一致时，传统的遗传咨询策略可能无法准确预测疾病的传递风险。因此，必须结合分子分析的多个层面，以更全面地理解基因变异对疾病的影响。例如，本案例中的患者虽然在基因组层面表现为框内缺失，但在 mRNA 和蛋白层面却表现出完全缺失的 dystrophin 蛋白，这表明其表型的严重性并非由基因组层面的变异直接决定，而是由其对剪接过程的影响所导致。

此外，这一案例也提醒我们，在面对复杂的遗传病例时，需要更加谨慎地评估基因变异的潜在影响。特别是在某些情况下，基因组层面的变异可能并不足以解释临床表型的严重性，而需要进一步的分子机制分析。因此，建议在临床实践中，将传统的基因检测方法与更先进的分子分析技术相结合，以提高诊断的准确性和全面性。

总之，本研究通过一个具体的临床案例，揭示了 DMD 基因变异与临床表型之间的复杂关系。患者的基因组变异最初被误判为与 BMD 相关的框内缺失，但实际上其导致的异常剪接机制引发了 dystrophin 蛋白的完全缺失，从而表现出典型的 DMD 表型。这一发现不仅挑战了传统的阅读框规则，也强调了在诊断 dystrophinopathy 时，采用分步骤的分子分析策略的重要性。未来的研究需要进一步探索类似变异的分子机制，并优化现有的基因检测策略，以提高对复杂遗传病例的识别和诊断能力。