苹果黑星病抗性基因Rvi2的精细定位与结构变异标记开发

《Journal of Experimental Botany》：Fine mapping, candidate gene identification and marker development for the apple scab resistance gene Rvi2

本研究针对苹果黑星病抗性育种中Rvi2基因缺乏精准分子标记的难题，通过构建俄罗斯苹果R12740-7A单倍型基因组和TSR34T15牛津纳米孔组装，成功将Rvi2精细定位至10,041 bp LTR反转录转座子插入区域，开发出Rvi2-ELG-10Kb结构变异标记并实现精准标记辅助选择，为苹果抗病育种提供了重要技术支撑。

　　

苹果作为全球重要的经济水果，其生产长期受到黑星病的严重威胁。这种由真菌Venturia inaequalis引起的病害，迫使果农大量使用化学杀菌剂进行防治，不仅增加生产成本，还带来环境污染和食品安全隐患。培育抗病品种是解决这一问题的根本途径，然而病原菌的快速进化常常使单一抗性基因在投入使用后几年内失效。更棘手的是，传统育种方法依赖田间表型筛选，周期长且效率低下，亟需开发精准的分子标记来加速抗病育种进程。

在这一背景下，新西兰生物经济研究所的研究团队聚焦于俄罗斯苹果R12740-7A来源的Rvi2抗性基因。该基因能够诱导叶片产生独特的星状坏死反应，是苹果抗病育种中的重要资源。然而，此前开发的分子标记与Rvi2基因存在1.2 cM的遗传距离，在实际育种中可能因重组事件而导致选择错误。因此，开发与抗性共分离的精准标记成为本研究的核心目标。

研究人员采用多层次技术策略展开攻关。他们首先利用PacBio HiFi测序技术构建了俄罗斯苹果R12740-7A的单倍型基因组，同时通过牛津纳米孔测序获得了Rvi2抗性材料TSR34T15的基因组组装。基于“皇家嘎拉”×TSR34T15杂交群体的361株后代，结合国际RosBREED SNP芯片8K阵列进行基因分型，构建了高密度遗传连锁图谱。通过重组单株分析，将Rvi2定位在染色体2上约303 kb的物理区间内。

在精细定位区域内，研究团队利用结构变异检测技术发现了一个10,041 bp的长末端重复反转录转座子插入，该插入与抗性表型完全共分离。进一步分析显示，这一LTR反转录转座子内部包含一个法尼基焦磷酸/香叶基香叶基焦磷酸合酶基因，距离潜在的防御相关基因仅约2 kb。为验证这一发现的育种应用价值，研究人员开发了基于5'荧光水解探针的Rvi2-ELG-10Kb分子标记，并在239份苹果种质和471株杂交后代中进行了验证，结果显示该标记与抗性表型完全一致。

基因表达分析揭示了候选基因的时序表达模式。接种黑星病菌后，MD02G1263000基因（编码氨基酸磷脂ATP酶）在抗性纯合个体中表现出显著的后期上调表达，而MD02G1264800基因（TIR-NBS-LRR类抗病基因）仅在抗性纯合个体中120小时出现显著上调。位于LTR插入内部的FPPS基因则保持稳定表达，提示其可能通过染色质重塑或代谢物合成等方式参与抗性调控。

这项发表于《Journal of Experimental Botany》的研究，不仅提供了高质量的苹果基因组资源，更重要的是开发出了与Rvi2抗性完全共分离的分子标记，将显著提高苹果抗黑星病育种的效率和准确性。研究揭示的结构变异与抗性关联机制，为理解植物抗病性进化提供了新视角，对果树乃至其他作物的抗病育种具有重要借鉴意义。

关键技术方法包括：利用PacBio HiFi和牛津纳米孔测序技术构建单倍型基因组；基于“皇家嘎拉”×TSR34T15杂交群体进行连锁分析和精细定位；开发HRM、SSR和TaqMan标记用于基因分型；通过结构变异检测识别LTR反转录转座子插入；建立5'荧光水解探针标记体系Rvi2-ELG-10Kb；采用定量RT-PCR分析候选基因表达模式。

Scab phenotyping

接种V. inaequalis分离物MNH120后，两个分离群体（“皇家嘎拉”×TSR34T15和选系Aד皇家嘎拉”）均表现出典型的Rvi2介导的星状坏死抗性反应。卡方检验证实抗感分离比符合1:1的单基因遗传模式，与之前报道的Rvi2遗传特性一致。

Linkage map construction

使用国际RosBREED SNP芯片8K阵列对188株后代进行基因分型，构建了TSR34T15的遗传连锁图谱。Rvi2位点被定位在连锁群2上，两侧标记对应“金冠”参考基因组27.96-32.26 Mb的物理区间。

Genome assembly of Russian apple R12740-7A

PacBio HiFi测序产生38Gb数据，最终组装获得两个单倍型基因组（Rhap1和Rhap2）和主要组装（Rp），BUSCO完整性评分均超过98.5%，LAI值表明组装质量较高。

Genome assembly of TSR34T15

牛津纳米孔测序产生62.29Gb数据，比较三种组装工具（Flye、Shasta和Canu）性能后，选择基于HFTH1基因组支架的Flye-Medaka组装作为最终版本。

Fine mapping of Rvi2 locus

通过重组断点分析将Rvi2精细定位到31.63-31.93 Mb的303 kb区间。结构变异分析发现156个SV，其中10,041 bp插入在抗感材料间呈现完全多态性。

New Rvi2 marker assay development and validation

开发的Rvi2-ELG-10Kb标记在239份种质中验证无误，所有116份Rvi2抗性材料均为杂合或纯合基因型，而123份已知不携带Rvi2的材料均不含该插入。

Targeted-sequencing enrichment and de novo assembly

长片段PCR和纳米孔测序证实10,041 bp插入为LTR反转录转座子，包含Ty3型LTR和两个基因：SWI/SNF复合物亚基和FPPS合酶家族基因。

Gene expression analysis

接种后时间序列表达分析显示，MD02G1263000在抗性纯合个体中后期显著上调，而FPPS基因表达稳定，提示其可能通过染色质调控或代谢途径参与抗性。

本研究成功将苹果黑星病抗性基因Rvi2精细定位至一个10,041 bp的LTR反转录转座子插入区域，开发出与之完全共分离的分子标记Rvi2-ELG-10Kb。这一标记在大量种质资源中验证无误，显著提升了标记辅助选择的准确性和效率。研究发现该LTR插入内部包含FPPS基因，可能通过调控邻近防御基因表达参与抗病反应。研究提供的高质量基因组资源和精准分子标记，为苹果抗病育种提供了重要工具，同时对理解植物抗病基因进化机制具有重要理论价值。