公猪精子中的瞬时受体电位通道4（TRPC4）：利用特异性抑制剂ML204进行免疫定位和功能分析

《Animal Reproduction Science》：Transient receptor potential channel 4 (TRPC4) in boar sperm: immunolocalization and functional analysis using the specific inhibitor ML204

本研究首次在猪精子中通过直接免疫荧光证实TRPC4通道的存在，并定位其中段和后顶体区。使用特异性抑制剂ML204发现，高浓度（22 μM）显著降低精子总活力（7.53%）和前向运动能力（6.88%），同时抑制膜电位（JC??比例增加）。在含咖啡因体系中，抑制效果加剧，可能与cAMP/PKA途径失衡有关。碱性pH条件下，其他离子通道补偿了TRPC4的抑制，部分恢复精子活力。结论指出TRPC4在调节精子运动和维持膜电位中起重要作用，但并非唯一机制。

　　
### 研究背景与意义
精子离子通道的调控是生殖生物学中的关键领域，其中瞬时受体电位通道（TRP）家族因参与钙离子稳态调控而备受关注。TRPC4作为TRP家族成员，在平滑肌收缩、神经信号传递及血管张力调节中发挥重要作用，但其功能在精子中的研究尚不充分。尽管已有研究证实TRPC通道在哺乳动物精子中可能参与运动、获能及顶体反应（如Lishko等，2011），但关于猪精子中TRPC4的具体定位与功能仍缺乏直接证据。此外，精子冷冻保存后复温过程中，钙离子内流异常可能导致运动能力下降，而TRPC4作为钙通道候选分子，可能在此过程中起关键作用。因此，本研究旨在通过直接免疫荧光和流式细胞术技术，首次验证猪精子中TRPC4的存在及其对运动能力的调控机制，并通过特异性抑制剂ML204探究其功能。

### 研究方法与设计
研究团队采用三组对照实验设计，综合运用分子生物学、细胞生物学及生殖工程学方法，系统评估TRPC4在精子功能中的作用：
1. **基础实验组**：使用常规冷冻缓冲液（pH 7.2），测试不同浓度ML204对精子运动能力及线粒体功能的影响。
2. **咖啡因干预组**：在冷冻缓冲液中添加2 mM咖啡因（激活cAMP-PKA通路），观察TRPC4抑制与咖啡因协同作用对精子复温后运动能力的干扰。
3. **碱性pH组**：将冷冻缓冲液pH调至8.2，模拟精子在生理碱性环境中的状态，评估TRPC4抑制的补偿机制。

实验关键步骤包括：
- **样本处理**：选用西班牙人工授精中心（AIM Ibérica）提供的杜洛克长白猪冷冻精子，通过梯度离心纯化精子悬液。
- **免疫荧光技术**：采用特异性抗TRPC4抗体（Abcam catalog ab153810），结合Hoechst 33342核染色，验证TRPC4在精子中段及后顶体区的定位。
- **流式细胞术分析**：通过多色荧光标记（PI、PNA、JC-1、MitoSOX等）评估精子存活率、顶体完整性、线粒体膜电位及氧化应激水平。

### 关键发现与结果分析
#### 1. TRPC4在猪精子中的定位与特异性验证
免疫荧光结果显示，TRPC4在猪精子中段（连接头部与尾部）及后顶体区特异性表达（图1）。阴性对照（ omitting primary antibody）和同型对照（IgG替代抗体）均未显示荧光信号，证实抗体特异性。这一分布与人类及小鼠精子中TRPC4的定位一致（Castellano等，2003），提示其在精子中可能参与能量代谢与运动调控。

#### 2. ML204抑制对精子功能的影响
- **基础缓冲液（pH 7.2）**：22 μM ML204显著降低总运动率（TM）和前向运动率（PM）达27.5%和25.9%，同时减少高膜电位精子（JC++）比例，表明TRPC4通过调控钙内流影响线粒体功能。值得注意的是，ML204未完全抑制运动能力，可能与精子中存在TRPC1/4异源复合体有关（Phelan等，2023），这类复合体对ML204的敏感性低于纯TRPC4通道。
- **咖啡因干预（pH 7.2）**：在激活cAMP-PKA通路的条件下，22 μM ML204进一步加剧运动抑制（TM和PM分别降至4.98%和4.26%），且线粒体活性（YoPro?/MTDR+）与膜电位（JC++比例）下降更显著。这表明ML204通过阻断TRPC4介导的钙信号，破坏cAMP-PKA与TRPC4的协同调控，导致运动能力失控。
- **碱性pH（8.2）**：碱性环境部分抵消了ML204的抑制效果，22 μM组TM（24.3%）和PM（24.3%）虽仍低于对照组，但与基础缓冲液中相同浓度组（7.5%）相比显著改善。流式细胞术显示，碱性pH通过激活电压门控钙通道（如CatSper）和钾离子通道（如Slo3），补偿TRPC4抑制导致的钙信号缺失，维持线粒体膜电位（JC++比例下降幅度较小）和运动能力。

#### 3. 补偿机制与通道互作
研究揭示，TRPC4并非唯一调控精子运动的钙通道：
- **pH依赖性通道激活**：碱性环境诱导CatSper和TRPV通道开放，促进钙内流（Cooray等，2023）；Slo3通道通过释放钾离子维持膜电位稳定（Zhao等，2025）。
- **异源复合体形成**：TRPC1与TRPC4的异源装配可能降低ML204的抑制效能（Phelan等，2023），导致部分运动能力保留。
- **氧化应激与膜流动性**：TRPC4抑制导致活性氧（MitoSOX+）比例上升（11 μM组120分钟MitoSOX+达44.1%），可能通过脂质过氧化破坏膜流动性（M540+比例升高）。

### 讨论与学术价值
#### 1. TRPC4在精子功能中的双重角色
- **正向调控**：TRPC4通过促进钙内流支持线粒体功能（JC++比例下降与膜电位降低相关），并可能通过激活PKA通路调控顶体反应（PNA+比例变化）。
- **负向调控**：过度钙信号可能抑制精子超激活运动（WOB参数升高），需与CatSper等通道协同调控。

#### 2. 冷冻保存后精子复温机制的启示
- **钙信号失衡**：冷冻导致精子膜损伤和钙外流，复温时TRPC4介导的钙内流对恢复运动至关重要。
- **pH依赖的代偿机制**：碱性环境通过激活备用通道（如CatSper）补偿TRPC4抑制，为优化冷冻液配方（如添加碱性调节剂）提供理论依据。

#### 3. 研究局限性
- **抗体特异性验证不足**：虽通过同型对照排除非特异性结合，但缺乏ML204竞争性实验或TRPC4基因敲除验证。
- **异源复合体未明确**：未分离纯化精子中TRPC4与其他通道的异源复合体，可能影响抑制剂效价评估。

### 结论与展望
本研究首次在猪精子中定位TRPC4，并证实其通过钙信号调控运动能力与线粒体功能。ML204抑制效果受环境pH与咖啡因协同作用影响，提示精子功能依赖多通道协同调控。未来研究可聚焦以下方向：
1. **异源复合体解析**：通过质谱鉴定TRPC4与其他通道（如TRPC1/CatSper）的相互作用界面。
2. **冷冻液优化**：基于pH补偿机制，开发含碱性成分（如碳酸氢钠）或钾离子缓冲剂的改良冷冻液。
3. **功能基因验证**：构建TRPC4基因敲除猪模型，直接评估其生理作用。

该成果为理解哺乳动物精子冷冻保存机制提供了新视角，对畜牧业中人工授精技术优化具有重要应用价值。