基于计算与实验方法鉴定耻垢分枝杆菌DnaE1高保真DNA合成的决定因素及其在结核病耐药性中的意义

《Nucleic Acids Research》：Identification of determinants of high-fidelity DNA synthesis in Mycobacterium smegmatis DnaE1 through in silico and in vivo approaches

本研究针对结核分枝杆菌耐药性机制，聚焦DNA复制关键酶DnaE1与DnaE2的功能差异。研究人员通过双熵值分析筛选出可能影响聚合酶保真度的氨基酸位点，并通过体内外实验验证发现掌区双突变D431S/R432D能显著提高突变频率。该研究首次揭示DnaE2通过降低核苷酸插入准确性实现易错复制的分子机制，为理解结核病耐药性产生提供了新视角。

　　

结核病这一古老的传染病至今仍是全球最致命的传染病杀手，而耐药结核病，特别是多重耐药和广泛耐药结核病的出现，使得疫情控制雪上加霜。与许多细菌通过水平基因转移获得耐药性不同，结核分枝杆菌的耐药性主要源于DNA复制过程中在药物靶标基因或药物活化酶基因中积累的突变。因此，理解DNA复制过程中的突变产生机制，尤其是那些导致错误掺入的分子基础，对于开发减缓耐药性产生的策略至关重要。

在分枝杆菌中，DNA复制由两个C家族DNA聚合酶执行：高保真的复制性DNA聚合酶DnaE1和在不同条件下表达的DnaE2。研究表明，在DNA损伤或抗生素暴露等不利条件下，DnaE2的表达与突变率增加相关，但其精确分子机制尚未明确。由于DnaE2难以单独进行生化研究，研究人员转向通过比较DnaE1和DnaE2的序列差异来探索影响聚合酶保真度的关键因素。

发表在《Nucleic Acids Research》上的这项研究，通过计算与实验相结合的方法，揭示了耻垢分枝杆菌DnaE1聚合酶高保真性的结构基础，并证实了DnaE2作为易错聚合酶的分子特征。研究人员发现掌结构域中的两个关键氨基酸残基是维持DnaE1高保真性的关键，而这两个残基在DnaE2中的自然变异可能导致其更开放的活性位点，从而允许错误核苷酸的掺入。

为开展本研究，作者主要应用了以下几项关键技术：双熵值序列分析用于筛选DnaE1与DnaE2间差异保守的氨基酸位点；dCas9介导的基因 knockdown 与回补实验系统用于在耻垢分枝杆菌体内评估DnaE1变体的功能；体外酶活实验通过锰离子依赖性错配延伸分析和时间进程实验评估聚合酶保真度；蛋白质结构建模与分析用于解释突变体的功能变化。

DnaE1变体设计基于双熵值分析

研究人员首先通过双熵值分析358个DnaE1和DnaE2同源序列，识别可能在两个聚合酶家族间功能分化的氨基酸位点。该方法通过比较整体香农熵与各亚家族香农熵之和，识别在DnaE1和DnaE2内部保守但在两个家族间存在差异的位点。分析结果显示，不同象限的残基具有不同的保守模式：象限1包含两个家族全局保守的残基（如催化位点D424和D426）；象限3则包含仅在单一家族内保守的残基，这些残基可能决定DnaE1和DnaE2的不同功能特性。

基于此分析，研究人员选择了16个DnaE1变体进行实验验证，包括11个单点或双点突变、2个环区删除和3个对照突变。这些变体分布在PHP结构域、拇指结构域、掌结构域和手指结构域，覆盖了蛋白质与DNA相互作用的关键区域。

dCas9介导的DnaE1 knockdown揭示DnaE1对变异的低容忍度

通过在耻垢分枝杆菌中建立dCas9介导的内源DnaE1 knockdown与变体回补系统，研究人员评估了各DnaE1变体对细胞生长的影响。结果显示，大多数DnaE1变体在缺乏内源DnaE1时无法支持细菌生长，表明DnaE1对其序列变异具有低容忍度。即使在內源DnaE1存在的情况下，多数变体也表现出生长缺陷，提示显性负效应。值得注意的是，DnaE2无法替代DnaE1的功能，但共表达时不影响生长，支持DnaE2通过独立于复制体的突变体发挥功能的假说。

双突变D431S/R432D显示突变频率增加

通过利福平抗性菌落计数评估各变体对突变频率的影响，研究人员发现掌结构域双突变D431S/R432D在体内实验中使突变频率增加7倍，且不影响细菌生长。PHP结构域的对照变体Y107G（外切核酸酶缺陷）使突变频率增加22倍，而其他PHP结构域变体（如D25N和F260A）在共表达情况下也适度增加突变频率。

体外酶活实验进一步验证了这些变体的功能变化。在锰离子存在下，D431S/R432D变体在三种DNA底物（T、C、G）上几乎完全延伸了引物，表明其更容易掺入并延伸错配核苷酸。时间进程实验显示，该变体在G底物上的全长产物产量比野生型高2.4倍，表明其核苷酸插入保真度降低。

D431S/R432D的位置提示更开放的DNA结合沟

结构分析显示，D431和R432位于掌结构域，紧邻催化残基D424和D426，与DNA模板链骨架相邻但不直接接触。这两个残基通过氢键与手指结构域的T598和D602相互作用，与R595共同形成一个跟随DNA骨架的沟槽。

AlphaFold模型预测显示，D431S/R432D突变破坏了与手指结构域的氢键网络，导致DNA结合沟槽变宽，形成更开放的活性位点。这种结构变化可能使DNA更容易适应错误掺入的核苷酸，或增加催化残基的灵活性，从而降低聚合酶的保真度。与DnaE2的对比分析支持这一假设，因为DnaE2在相应位置自然存在类似的氨基酸（S465和D466），且缺乏明显的DNA结合沟槽。

研究结论与讨论部分强调，这项工作首次通过实验证实DnaE2作为易错聚合酶的生化基础。与高保真聚合酶DnaE1相比，DnaE2不仅缺乏功能性外切核酸酶校对活性，其聚合酶活性本身也具有更低的核苷酸插入和延伸保真度。掌结构域双残基D431和R432的鉴定，揭示了维持DnaE1高保真性的关键结构特征，而这两个残基在DnaE2中的自然变异可能是其易错活性的分子基础。

这项研究的意义在于为理解结核分枝杆菌耐药性产生机制提供了新的分子视角。DnaE2作为突变体核心组件，其在压力条件下的表达直接关联于细菌适应性突变和耐药性发展。对DnaE1和DnaE2功能差异的深入理解，不仅有助于阐明结核病耐药性的产生机制，也可能为未来针对DNA复制保真度的新型抗结核策略开发提供思路。通过靶向易错复制途径，可能有望减缓耐药结核病的出现，从而改善全球结核病控制形势。