《Biochemical Engineering Journal》：Divanillin synthesis from vanillin by horseradish peroxidase in consideration of mathematical model and morphology of product
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本研究通过调节辣根过氧化物酶（HRP）浓度和溶剂（甲醇/乙醇）探究其对二香豆素合成及产物形貌的影响，构建数学模型分析溶剂对酶失活及底物活性的影响，结合SEM观察发现产物形貌随条件变化呈现球状和针状结构。该成果为利用木质素单体开发新型功能材料奠定理论基础。
寺西郁也（Ikuya Teranishi）| 伊藤修介（Shusuke Ito）| 森田信太郎（Shintaro Morisada）| 大户圭辅（Keisuke Ohto）| 川北英隆（Hidetaka Kawakita）
日本佐贺大学科学与工程学院应用化学系，佐贺840-8502
摘要
香兰素是来自木质素的单体之一。我们利用辣根过氧化物酶（HRP）的酶促反应，从香兰素合成了二香兰素，并研究了HRP浓度和反应介质对底物反应性以及产物二香兰素形态的影响。通过数学建模分析了溶剂引起的酶失活和底物反应性对底物浓度的影响。实验表明，HRP的用量会影响反应介质导致的酶失活。定量结果显示，改变反应介质中甲醇的浓度可以增加香兰素的溶解度，并提高其与HRP的接触效率。对沉淀物的扫描电子显微镜（SEM）观察显示，这些沉淀物呈球形或针状，其形态会随反应条件的不同而变化。二香兰素是一种具有潜在价值的生物质转化产物，这项研究将为新型材料的开发奠定基础。
引言
基于纤维素、半纤维素和木质素的生物质材料已被广泛研究。纤维素和半纤维素因其柔韧性和刚性以及易于向羟基引入官能团而受到关注[1]、[2]。木质素是一种存在于木材中的大分子，由通过多种C-C和C-O键连接的苯丙素单体（单木质素）组成，结构非常坚硬，且在溶剂中的溶解度很低[3]、[4]。因此，直接合成用于改性的有机化合物或修改聚合物较为困难。目前，已有研究通过引入PEG或烷基基团来提高木质素的溶剂溶解度，并将其作为材料使用[5]、[6]。然而，如果能够对木质素聚集体进行改性，就可以从单体层面制备出结构多样的聚合物。如果能够根据木质素单体骨架构建相关材料，那么木质素的潜力就能得到最大发挥。
香兰素是木质素的单体之一，含有醛基。二香兰素是由两个醛基组成的双官能单体，可以与含有氨基和醇基的单体形成亚胺和酯键，从而制备出聚合材料。例如，已有研究利用二香兰素制备聚合物[7]、[8]。由于二香兰素具有两个醛基，它可以与二胺反应生成亚胺聚合物[9]、[10]。这种聚合物具有制备胶粘剂[11]、可折叠聚合物[13]和光电材料（如OLED）[10]的潜力。可以使用香兰素作为底物，通过辣根过氧化物酶（HRP）和过氧化氢来合成二香兰素[14]、[15]。此外，二香兰素本身还可用作含氧化锌的牙科材料[16]。HRP产生的二香兰素浓度受反应溶剂类型和浓度、酶以及底物种类的影响[17]、[18]。沉淀物的形态会随反应条件的不同而变化。利用HRP和酚类底物进行的多酚聚合已有相关研究[19]、[20]、[21]、[22]，虽然已知会形成球形颗粒，但其形成机制尚未明确。
HRP的活性中心涉及铁离子的氧化还原反应。产物的浓度受底物和酶浓度的影响。此前，Buchanan和Nicell提出的数学模型考虑了酶活性中心的变化以及酚类底物的参与[23]。通过进一步考虑反应溶剂对HRP结构的失活作用，可以定量描述HRP生成二香兰素的反应过程，并获得反应速率常数以预测二香兰素的生成浓度。
在本研究中，通过改变HRP和溶剂（甲醇或乙醇）的浓度来合成二香兰素。我们建立了数学模型，以描述底物和酶浓度对二香兰素浓度变化的影响，同时考虑了反应溶剂对HRP的失活作用。虽然已有利用HRP合成二香兰素的相关研究及其应用探索，但尚未有研究将有机溶剂的失活效应纳入HRP的数学模型中进行定量分析。这有助于深入理解HRP对底物的识别机制。我们对数学模型的参数进行了比较，并考虑了底物与HRP的相互作用。为了研究产物沉淀物的形成过程，还考察了HRP浓度和溶剂对其形态的影响，以及二香兰素的生成机制。虽然水分损失的现象已被广泛认知，但本研究的创新之处在于从木质素降解产物香兰素出发，对其酶促反应的动力学进行了分析。本研究结果有助于基于木质素合成具有双官能性的二香兰素，进而开发新型聚合物。
材料
香兰素（批号GI01）购自日本东京Kasei公司。30%过氧化氢溶液（试剂级，批号ESH6999）购自日本Wako Pure Chemicals公司。辣根过氧化物酶（以下简称HRP，批号SKH2826）同样购自日本Wako Pure Chemicals公司。其他化学品均为分析级或更高级别。
利用HRP反应合成二香兰素
将不同量的HRP加入5毫升蒸馏水中，配制HRP溶液。500毫升的Erlenmeyer烧瓶中加入了相应的HRP溶液。
HRP用量和溶剂浓度对二香兰素合成的影响
在利用HRP从香兰素合成二香兰素的过程中，酶浓度、底物浓度和溶剂都会产生影响。底物与HRP活性中心的结合受到HRP中铁离子复合物的影响，进而影响二香兰素的合成。良好的溶剂对水的溶解性也会影响HRP的构象，进而影响二香兰素的形态。结论
香兰素作为木质素的组成单体，可用于制备生物质衍生的聚合物。与其它单体结合后的二香兰素具有作为功能性材料的潜力。在本研究中，我们通过改变HRP和甲醇的浓度来合成二香兰素，并研究了底物浓度和产物形态的变化。通过考虑酶活性的动力学数学模型对香兰素的反应性进行了评估。
作者贡献声明
寺西郁也（Ikuya Teranishi）：数据可视化、方法论设计、实验研究、数据分析。伊藤修介（Shusuke Ito）：方法论设计、实验研究。大户圭辅（Keisuke Ohto）：文章撰写、审稿与编辑。森田信太郎（Shintaro Morisada）：文章撰写、审稿与编辑。川北英隆（Hidetaka Kawakita）：文章撰写、审稿与编辑、数据可视化、实验研究、概念构建。
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在撰写本文期间，作者使用了OpenAI的ChatGPT Plus工具来优化语法和标点符号，提升文章的学术性表达，确保概念和论点的清晰传达。使用该工具后，作者对内容进行了必要的修改和编辑，并对最终发表的内容负全责。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究部分得到了日本佐贺大学及佐贺大学实验科学分析中心的支持。
