在出芽酵母中，两种形式的钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Cmk2的表达会因钙胁迫而受到差异性调控

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms》：Expression of two forms of the calcium/calmodulin-dependent protein kinase Cmk2 is differentially regulated in response to calcium stress in budding yeast

钙信号调控中酵母Cmk2蛋白的磷酸化特性及功能研究。Cmk2作为钙调蛋白依赖性蛋白激酶II的酵母同源物，通过CDRE motif受Crz1调控，在钙应激下形成慢（SM）和快（FM）迁移异构体。研究发现K76和S317残基分别调控FM和SM-Cmk2的钙诱导表达及稳态水平。突变分析表明Cmk2调控钙信号存在Crz1依赖及非依赖双重机制，其功能与哺乳动物CaMKII存在差异

　　

蒋凌霍|魏柳丹|顾一颖|姜佩根|内森·斯奈德|廖秀芳|莫一平|潘凌鑫|魏春宇|凯尔·W·坎宁安

酵母生物学与发酵技术实验室，国家非食品生物精炼工程技术研究中心，非食品生物质与酶技术国家重点实验室，广西生物质工程技术研究中心，广西科学院生物科学与技术研究所，南宁，广西，530007，中国

摘要

Cmk2是哺乳动物钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）的同源物，在酵母细胞中作为钙信号的负调节因子。CMK2基因的转录由锌指转录因子Crz1通过启动子中的CDRE基序控制。在本研究中，我们表征了Cmk2的蛋白质表达和磷酸化过程。从酵母细胞中纯化的Cmk2蛋白会发生自磷酸化。在酵母细胞应对钙胁迫时，检测到了两种形式的Cmk2蛋白：低迁移率的(sM-Cmk2)和高迁移率的(fM-Cmk2)。在没有钙胁迫的情况下，Cmk2主要以sM-Cmk2的形式存在。删除CNB1会延迟两种形式的钙诱导，但仅降低钙诱导的fM-Cmk2的水平。200 mM的细胞外钙浓度会导致两种形式的Cmk2达到最大诱导水平。因此，除了钙/钙调神经磷酸酶信号通路外，Cmk2蛋白的表达还受其他因素的控制。此外，我们的突变分析表明，Cmk2的K76残基对于两种形式的Cmk2的钙诱导和稳态表达水平是必需的。S317残基（对应于哺乳动物CaMKII中的O-连接糖基化位点S279）也负责SM-Cmk2的钙诱导。

引言

钙稳态和钙/钙调神经磷酸酶信号通路在真核细胞中高度保守[1,2]。酿酒酵母是最简单的真核模式生物，为解析这些过程提供了宝贵的遗传和分子工具[3,4]。在中，细胞质Ca²⁺浓度通常在不同环境条件下介于50 nM到200 nM之间[5,6]。响应细胞外胁迫时，细胞质Ca²⁺水平会突然升高，从而激活效应蛋白，引起生理变化[7]。作为效应蛋白之一，钙调蛋白激活蛋白磷酸酶钙调神经磷酸酶，这是一种由催化亚基（Cna1或Cmp2）和调节亚基Cnb1组成的异二聚体。钙调神经磷酸酶的完全激活需要Ca²⁺与调节亚基Cnb1结合，并且Ca²⁺-钙调蛋白与Cna1结合，这会解除其底物结合口袋中的自抑制序列及其催化活性位点中的自抑制结构[8,9]。钙调神经磷酸酶有许多靶点，参与调节质膜、其他细胞内膜、线粒体、核孔复合体和中心体/纤毛等处的过程[10]。钙调神经磷酸酶的一个功能是去磷酸化细胞质中的转录因子Crz1，使其定位于细胞核，并通过与其启动子中的钙调神经磷酸酶依赖性响应元件（CDRE）结合来激活其靶基因[[11], [12], [13]]。这些靶点包括液泡Ca²⁺-ATP酶基因PMC1、内质网/高尔基体Ca²⁺-ATP酶基因PMR1以及编码质膜上钙吸收负调节因子的RCH1基因[14,15]。

哺乳动物钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）是多种组织中钙信号的调节因子，并在大脑中充当记忆分子。此外，CaMKII在包括大脑、心脏、肝脏、胰腺、肾脏和眼睛在内的多种器官的病理过程中起着重要作用[[16], [17], [18], [19], [20], [21], [22]]。哺乳动物CaMKII有两个酵母同源物，Cmk1和Cmk2。Cmk2对于孢子萌发是必需的，但对于营养生长则不是[23]。与CaMKII类似，Cmk1和Cmk2都表现出广泛的底物特异性，但它们分别优先被牛钙调蛋白（CaM）和酵母钙调蛋白（Yeast CaM）激活[24]。此外，在细菌细胞中表达的纯化Cmk2可以通过自磷酸化被激活，而Cmk1则不能，尽管它们都含有用于激活自磷酸化的苏氨酸残基。Cmk2具有一个保守的磷酸化序列RVET₃₁₆，该序列位于与哺乳动物CaMKII中的RQET₂₈₆自磷酸化位点几乎相同的位置，表明Cmk2表现出类似于大脑酶的调节行为[23]。此外，Cmk2与Rch1共同作用，在响应钙胁迫时负调节钙的吸收[15,25]。我们最近发现Cmk2负调节Crz1介导的钙信号传导以及PMR1和PMC1的表达[14]。Cmk2还具有一个独立于Crz1的钙敏感性功能[14]。CMK2基因的转录由钙调神经磷酸酶响应性锌指转录因子Crz1和通用应激响应转录因子Msn2通过其启动子中的CDRE位点（5′ G_?177AGGCT 3′）和STRE位点（5′ C_?155CCCT 3′）分别控制[26,27]。在本研究中，我们表征了酵母细胞在应对钙胁迫时Cmk2的蛋白质表达情况。

章节片段

菌株、培养基和引物

酵母菌株来自Invitrogen（美国）提供的二倍体和单倍体缺失突变体集合[4,15]。酵母菌株在YPD或合成缺失（SD）培养基上培养。YPD培养基含有20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨和10 g/L酵母提取物。本研究中使用的引物列于表S1中。

克隆

来自两个人类cDNA克隆pDONR223-CAMK2B和pDONR223-CAMK2D的1512-bp CAMK2B和1437-bp CAMK2D cDNA片段，使用引物对2B-F/2B-R和2D-F/2D-R进行了PCR扩增

Cmk2与其两种哺乳动物同源物CaMKII之间的氨基酸序列比较和功能互补性

酵母Cmk1和Cmk2蛋白具有与哺乳动物CaMKII的两个同源异构体（Beta和Delta）高度保守的催化结构域，尽管它们的N端和C端区域存在差异（图S1）。Cmk2与哺乳动物CaMKII的序列同源性高于Cmk1，因为Cmk2、CaMKII Beta和CaMKII Delta之间共有28个氨基酸是保守的，而Cmk1、CaMKII Beta和CaMKII Delta之间只有13个氨基酸是保守的（图S1）。为了测试这些

讨论

哺乳动物CaMKII是一种多功能激酶，具有广泛的底物范围，并且其功能独立于其催化活性[16]。酵母中的CaMKII同源物Cmk2在调节钙信号传导和两个钙泵基因PMR1和PMC1的表达中起负作用[14]。在本研究中，我们发现尽管CaMKII基因在氨基酸上有显著的同一性和相似性，但它们似乎并不能补充Cmk2在钙敏感性方面的功能

CRediT作者贡献声明

蒋凌霍：写作 – 审稿与编辑，写作 – 原稿撰写，监督，资源管理，项目协调，资金获取，数据分析，数据管理，概念构思。魏柳丹：研究。顾一颖：研究。姜佩根：研究。内森·斯奈德：研究。廖秀芳：研究。莫一平：研究。潘凌鑫：研究。魏春宇：研究。凯尔·W·坎宁安：研究。

资助

广西科技基地与人才专项项目（项目编号：2021AC18023）和广西创新驱动发展重大科技创新基地建设项目（项目编号：2022-36-Z06）。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。