《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》：Astragalus polysaccharide hinders cervical cancer immune escape by targeting NR3C2 and activating SLC40A1
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黄芪多糖通过靶向NR3C2和激活SLC40A1抑制宫颈癌免疫逃逸。体外实验显示APS显著抑制HeLa和SiHa细胞增殖（IC50分别为3.79和3.91 mg/mL），激活CD8+ T细胞并降低LAG3/TIM3表达。体内实验证实APS通过上调NR3C2促进SLC40A1转录，抑制肿瘤免疫逃逸。NR3C2沉默逆转了APS的抑癌效应，而SLC40A1过表达增强APS效果。研究揭示了APS调控NR3C2-SLC40A1轴抑制宫颈癌免疫逃逸的机制。
刘文志|张璐|王一欣|蒋小红|谭金婷|张颖|傅园园
江苏省常州市中医院医学教育科，213003，中国
摘要
黄芪多糖（APS）在预防肿瘤进展和免疫逃逸方面显示出良好的效果。本研究探讨了APS在宫颈癌（CC）免疫逃逸中的作用机制。研究了不同浓度APS对CC细胞系（HeLa和SiHa）存活率的影响，并检测了APS处理后CC细胞的免疫逃逸能力。通过皮下注射U14细胞构建了体内模型，以研究APS对免疫逃逸的影响。利用多个数据库筛选了APS的下游靶点，并验证了APS与NR3C2之间的调控关系。通过生物信息学分析确定了NR3C2的下游分子，并验证了其调控机制。在体内和体外实验中检测了NR3C2和SLC40A1对免疫逃逸的影响。APS抑制了CC细胞的免疫逃逸，并激活了NR3C2表达和CD8+ T细胞功能。NR3C2敲低逆转了APS对免疫逃逸和CC细胞恶性行为的抑制作用。NR3C2在SLC40A1启动子区域富集，并促进了SLC40A1的表达。SLC40A1的上调增强了APS对CC细胞免疫逃逸的抑制作用。APS通过靶向NR3C2和激活SLC40A1来抑制CC细胞的免疫逃逸。
引言
细胞的异常变化，通常称为原位发育不良或癌变，可能发展成宫颈癌（CC），这种变化是不可逆的，并可能发生转移[1]。CC是最常见的癌类型，导致全球女性的发病率和死亡率逐年增加[2]。超过90%的CC病例与人乳头瘤病毒有关，该病毒可引起肿瘤微环境中的慢性炎症和免疫逃逸[3]。尽管一些肿瘤细胞可以被免疫系统识别，但肿瘤细胞的固有机制帮助它们逃避免疫反应并加速转移[4]。因此，防止免疫逃逸可能是阻止CC进展和转移的根本策略。
黄芪是一种传统中药，其黄芪多糖（APS）是最关键的天然活性成分[5]。APS具有多种药理作用，包括抗肿瘤、抗菌、抗病毒和免疫调节作用[6]。值得注意的是，我们之前的研究表明，APS以浓度依赖的方式抑制HeLa细胞的生长[7]。APS对免疫检查点的强大免疫调节作用引起了广泛关注。APS激活CD4+和CD8+ T细胞，抑制前列腺癌细胞的迁移，并降低PD-L1的表达[8]。APS在CC中促进免疫逃逸的机制尚不清楚。
核受体是调节许多生理过程的转录因子，其失调可能导致恶性肿瘤、炎症性疾病和代谢紊乱[9]。核受体亚家族3 C组成员2（NR3C2）与健康对照组和结直肠癌患者外周血中的循环免疫亚群呈正相关[10]。NR3C2的表达与透明细胞肾细胞癌中的CD4+和CD8+ T细胞呈正相关，NR3C2过表达的抗癌活性可能归因于高水平的免疫细胞浸润[11]。我们的初步分析表明，NR3C2是GSE64217数据集中差异表达基因（DEG）的独特交集，是CC相关基因和人类转录因子中相关性得分最高的50%的基因。然而，NR3C2在CC中的作用仍不明确。
溶质载体家族40成员1（SLC40A1，也称为FPN1）是SLC40转运蛋白家族的唯一成员，参与细胞铁转运、铁稳态、代谢状态和癌症进展[12]。SLC40A1位于2号染色体上，包含8个外显子，编码一种570个氨基酸的蛋白质[13]。SLC40A1是一种与铁死亡相关的关键基因，在G12Ci耐药的KRAS突变癌细胞中表达下调[14]。SLC40A1影响细胞因子相互作用和免疫微环境，从而改善胶质母细胞瘤患者的预后[15]。我们的初步分析显示，NR3C2表达与宫颈鳞状细胞癌（CESC）中的SLC40A1表达显著正相关，且NR3C2能够结合SLC40A1的启动子区域。然而，SLC40A1在免疫逃逸和CC中的作用仍不清楚。基于以上信息，本研究旨在探讨APS、NR3C2和SLC40A1对CC免疫逃逸的潜在作用。
章节片段
细胞培养与处理
人类CC细胞系Hela（CL-0101）和SiHa（CL-0210）以及人类宫颈上皮细胞（HcerEpi）（CP-H059）购自Procell（中国湖北武汉）。小鼠CC细胞U14（SNL-591）购自Sunncell（中国湖北武汉）。Hela和SiHa细胞在最小必需培养基（PM150410，Procell）中培养，U14细胞在DMEM（11,965,092，Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）中培养，并添加10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素-链霉素液体APS显著抑制CC细胞的免疫逃逸
CCK-8实验显示，APS以浓度依赖的方式抑制CC细胞的存活率（图1A）。APS的IC50值分别为HeLa细胞的3.79 mg/mL和SiHa细胞的3.91 mg/mL；因此，选择3 mg/mL的APS进行后续实验，该浓度对细胞造成中等程度的损伤。APS处理的HeLa和SiHa细胞与CD8+ T细胞共培养，RT-qPCR结果显示APS组中CD8+ T细胞的LAG3和TIM3 mRNA表达降低（图1B）。PD-L1蛋白表达显著减少讨论
尽管基于免疫检查点的免疫疗法取得了巨大进展，但只有部分患者对其产生反应，表明免疫逃逸仍然是免疫疗法的主要障碍[23,24]。多项研究强调了APS在抑制肿瘤细胞生长方面的作用[25,26]。我们的研究发现，APS通过上调NR3C2和转录激活SLC40A1表达来刺激CD8+ T细胞的活化并抑制CC细胞的免疫逃逸（图10）。
记忆CD8+ T细胞表达
结论
总之，本研究在体外和体内实验中证明了APS通过上调NR3C2和SLC40A1表达发挥的抗肿瘤作用。APS有潜力提高免疫疗法的效果，同时减轻毒性副作用。
以下是与本文相关的补充数据。
资助
本工作得到了江苏省中医药科技发展计划项目（编号：MS2023084）的支持。
致谢
我们感谢江苏省中医药科技发展计划项目（编号：MS2023084）提供的资金支持。
