利用钌组装在吡咯烷基肽核酸-DNA杂化体上的电化学传感器实现HIV-1 DNA的直接检测

《Bioelectrochemistry》：Electrochemical sensor for direct HIV-1 DNA detection using ruthenium assembled on a pyrrolidinyl peptide nucleic acid-DNA hybrid

本工作设计了一种基于acpcPNA探针的电化学DNA生物传感器，可直接检测HIV-1 cDNA无需扩增或变性。传感器通过chitosan/glutaraldehyde修饰的碳电极固定探针，利用双链入侵机制增强六氨合铼(III)氧化还原指示剂的富集，实现线性范围5-75 nM（LOD:1.34 nM），临床样本检测达10^5 copies/mL。集成蓝牙和近场通信芯片，证明其适用于资源有限地区的快速HIV诊断。

　　这项研究提出了一种新型的电化学DNA生物传感器，旨在直接、无需标记且高灵敏度地检测人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的DNA。该生物传感器利用了改良的电极表面，通过固定特定的探针来实现对目标DNA的高效识别。具体而言，研究人员将一种名为acpcPNA的肽核酸探针固定在经过壳聚糖和戊二醛化学修饰的丝网印刷碳电极上，从而促成了与目标DNA的双链入侵过程。在存在目标DNA的情况下，形成的双链入侵结构会促使带正电荷的六胺钌（III）（Ru(III)）红色氧化还原指示剂发生静电积累，这种变化可以通过方波伏安法进行检测。通过这一方法，该生物传感器能够有效检测合成的HIV-1 DNA，并且在浓度范围为5-75纳米摩尔（检测限为1.34纳米摩尔，定量限为4.44纳米摩尔）内表现出良好的线性响应。同时，该传感器还能用于临床样本中的HIV-1 cDNA检测，检测范围为10^3至10^5拷贝/毫升（检测限为2.25×10^2拷贝/毫升，定量限为7.50×10^2拷贝/毫升），并且与标准的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法在选择性和准确性方面表现出高度一致性，相关系数分别为0.9988和0.9905。这一成果表明，该平台不仅能够实现对HIV-1 DNA的快速检测，还能够显著减少检测过程中的复杂步骤，提高其实用性。

HIV-1是一种逆转录病毒，其遗传物质为单链RNA。感染HIV-1会导致一系列细胞损伤、免疫系统紊乱、全身性病理变化以及长期的健康问题。根据世界卫生组织（WHO）和联合国艾滋病规划署（UNAIDS）的最新估计，全球有超过4000万人感染HIV，而令人担忧的是，不到10%的感染者知道自己携带病毒。这一现状突显了开发便捷、快速且准确的诊断工具的迫切需求，以支持早期发现、有效治疗和防止病毒传播。目前的标准HIV检测方法，如酶免疫分析（EIA）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和Western blot，虽然广泛应用，但也存在明显的局限性，例如较长的窗口期、早期感染时的检测灵敏度不足、成本高昂以及无法区分感染的不同阶段。相比之下，核酸扩增技术（NAATs），如聚合酶链反应（PCR），虽然在灵敏度和早期检测方面具有优势，但其依赖于复杂的设备、专业的试剂、较长的检测时间和受过训练的人员，这些因素使其难以在资源有限的环境中部署。

为了解决上述问题，电化学生物传感器作为一种替代方案逐渐受到关注。这类传感器以其高灵敏度、快速响应、易于操作、低成本以及潜在的微型化能力而闻名，特别适用于分散式和现场部署的诊断需求。近年来，多种电化学平台被开发出来，用于检测与HIV相关的生物标志物，如蛋白质、抗原、抗体、RNA和DNA，这些平台在选择性和检测限方面取得了显著进步。然而，许多现有的电化学DNA传感器仍然依赖于复杂的步骤，如DNA变性或标记，这在一定程度上限制了它们在实际应用中的可行性。

为了克服这些障碍，研究人员提出了一种简化且无需标记的电化学DNA传感器，该传感器采用了一种新型的探针——acpcPNA。这种探针是由Vilaivan团队开发的一种构象受限的肽核酸，相较于传统的DNA或经典PNA探针，具有更高的杂交效率、热稳定性和序列特异性。acpcPNA的刚性环状结构使其在杂交过程中形成稳定的螺旋几何结构，从而减少了自杂交现象，并增强了对错配序列的识别能力。此外，其中性伪肽骨架能够有效避免与带负电的DNA之间的静电排斥，使得在低盐条件下也能实现高效的杂交，这对生物传感器的应用具有重要意义。acpcPNA不仅能够与单链DNA形成稳定的双链结构，还能在无需DNA变性的前提下入侵双链DNA，这一特性大大简化了检测流程，提高了检测的效率和准确性。

acpcPNA的这些优点使其成为一种理想的探针，用于实现对核酸的高选择性、稳定性和灵敏度检测。已有研究表明，acpcPNA在病毒检测领域展现出广阔的应用前景，包括HIV-1、人乳头瘤病毒（HPV）、丙型肝炎病毒（HCV）以及严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的检测。此外，该研究团队还曾报告过基于微流控和电致发光技术的acpcPNA平台，用于HIV-1和HCV的多目标检测。然而，这些设备通常涉及昂贵的材料、繁琐的制造过程以及多步骤的操作，这在一定程度上限制了它们在现场检测中的应用。因此，开发一种低成本、便携且无需标记的电化学检测平台，对于提高HIV检测的可及性和实用性具有重要意义。

为了进一步提升该传感器的实际应用价值，研究人员对不同的便携式电位计系统进行了评估，包括传统型、蓝牙型和近场通信（NFC）型设备。这种比较分析在文献中较为少见，为实际应用中的分析性能与现场部署之间的权衡提供了重要的参考。尽管NFC系统在灵敏度上略逊于其他系统，但它具有出色的便携性，这使得其在资源匮乏或现场检测环境中更具优势。通过与这些便携式设备的成功集成，该生物传感器展现出良好的灵活性和适应性，为HIV的早期诊断和更广泛的分子诊断提供了新的可能性。

该研究的核心在于如何利用acpcPNA探针的特性，结合电化学检测方法，实现对HIV-1 cDNA的直接检测。这一过程的关键在于电极表面的化学修饰，通过壳聚糖和戊二醛的处理，为探针的固定和后续的杂交反应提供了适宜的环境。在实际操作中，探针与目标DNA的杂交会引发Ru(III)指示剂的静电积累，这种变化可以通过方波伏安法进行定量分析。这种方法避免了传统的DNA变性步骤，使得整个检测流程更加简洁，同时也降低了对复杂设备和专业操作人员的依赖。此外，由于电化学检测方法本身具有较高的灵敏度和选择性，因此该平台在检测HIV-1 cDNA时能够保持较高的准确性和可靠性。

为了验证该生物传感器的性能，研究人员对其进行了系统的表征，包括扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）。这些表征手段帮助确认了电极表面的结构变化以及探针的固定效果，为后续的检测性能评估提供了重要的理论基础。通过这些实验，研究人员能够全面了解该平台在不同条件下的行为，并进一步优化其性能。例如，SEM图像显示了电极表面在不同修饰步骤后的微观结构变化，而FT-IR光谱则揭示了壳聚糖和戊二醛在电极表面的化学结合情况。CV和EIS测试则用于评估电极的电化学性能，确保其在实际检测中能够稳定地响应目标DNA的存在。

除了在实验室条件下的性能验证，研究人员还对实际临床样本进行了测试，以评估该传感器在现实环境中的适用性。通过使用不同类型的便携式电位计系统，他们能够观察到该平台在实际应用中的表现，并进一步优化其设计以适应多样化的检测需求。这种对实际应用环境的考虑，使得该生物传感器不仅在实验室中表现出色，而且具备良好的现场适应能力。此外，该平台的可扩展性也为未来开发更广泛的分子诊断工具提供了可能，例如用于检测其他病毒或病原体的DNA或RNA。

在总结该研究时，研究人员指出，他们成功开发了一种新型的电化学HIV-1 DNA传感器，该传感器采用acpcPNA探针固定在电极表面，能够高效地捕获HIV-1 cDNA目标。该平台无需DNA变性步骤，简化了检测流程，提高了检测效率。通过与便携式设备的集成，该传感器不仅实现了高灵敏度和选择性的检测，还为资源有限地区的HIV诊断提供了新的解决方案。此外，该研究也为其他类型的分子检测平台提供了参考，特别是在不需要扩增或变性步骤的情况下，如何实现对特定核酸的快速、准确和便携检测。

该研究的成果具有重要的现实意义。在资源匮乏或偏远地区，传统的HIV检测方法往往受到设备、试剂和专业人员的限制，难以广泛应用于大规模筛查。而电化学生物传感器由于其低成本、易于操作和便携性，为这些地区的HIV诊断提供了新的可能性。此外，该平台的开发也为未来的现场诊断设备设计提供了技术借鉴，特别是在如何利用新型探针和便携式检测系统相结合，以实现对复杂病原体的快速检测方面。随着技术的不断进步，电化学检测方法有望在更多领域得到应用，例如环境监测、食品安全和传染病防控等。

总体而言，这项研究通过创新性的设计和严格的实验验证，成功开发了一种高效、简便且适用于现场的HIV-1 DNA检测平台。该平台不仅克服了传统检测方法的诸多局限，还为未来的分子诊断工具提供了新的思路和技术支持。通过进一步优化和推广，该生物传感器有望成为HIV检测领域的重要工具，特别是在需要快速、准确和低成本检测的环境中。此外，该研究还强调了跨学科合作的重要性，展示了化学、生物技术和电子工程等领域的深度融合如何推动新型诊断技术的发展。