一种由脊髓损伤患者产生的多物种混合尿 catheter 生物膜模型

《Biofilm》：A model, mixed-species urinary catheter biofilm derived from spinal cord injury patients

基于临床尿路导管样本建立多菌种生物膜模型，通过宏流体系统模拟动态尿路环境，分析显示混合生物膜中细菌对抗生素的耐受性显著高于单一菌种，且流动条件可增强耐药性。基因组测序与耐药基因检测揭示多重耐药机制及菌株间协同效应，为导管感染治疗提供新模型。

　　### 多种微生物的复杂性与尿道感染的关系

尿道感染是长期使用导尿管患者中常见的问题，这种感染通常由多种细菌形成的生物膜引起。这些生物膜在导尿管上广泛存在，并且导致了无症状菌尿症和频繁的有症状感染。由于生物膜的复杂性和多样性，单一种群模型常常无法准确反映实际的生物膜动态。因此，本研究采用了临床导尿管生物膜样本，这些样本来源于脊髓损伤（SCI）患者的导尿管，包含5到10种不同的细菌，以建立多物种生物膜模型。最终的模型包含了2到4种细菌，从而更真实地模拟了体内感染的复杂性。

### 多物种生物膜的特性与挑战

多物种生物膜不仅具有更高的生存能力，还表现出对各种环境压力的更强耐受性，包括营养缺乏、极端盐度、pH值、温度、紫外线、氯化物、抗菌剂以及免疫细胞吞噬等。此外，多物种生物膜的形成和发育涉及复杂的微生物互动，包括改变病原体的毒力、产生次级代谢产物、水平基因转移、定植潜力、持续性、生物膜发展以及增强的抗应激能力。这些互动使得生物膜比单一种群更难以被抗生素和免疫系统清除。

然而，实验室中模拟这种复杂生物膜仍然面临许多挑战。传统的静态、微孔和微流体系统虽然广泛使用，但它们往往无法准确反映体内条件。例如，这些系统在模拟体内环境时可能会出现表面特性、生物互动、表面均匀性、亲水性和疏水性、剪切力、抗菌防御能力以及生物膜结构等方面的差异。由于这些因素的不一致，建立一个能全面模拟膀胱环境的模型变得非常困难。

为了克服这些挑战，本研究采用了一种基于人工尿液流动的宏流体系统，以更真实地模拟体内感染的动态过程。通过使用临床相关的细菌分离物，研究人员能够在实验室环境中重建一个稳定的多物种生物膜模型，从而更准确地研究生物膜的抑制、破坏以及微生物之间的相互作用。

### 多物种生物膜的建立与分析

研究人员从脊髓损伤患者的导尿管中提取了多种细菌的生物膜样本，并通过宏流体系统在导尿管内部表面培养。这些样本经过三次连续的培养过程，以确保生物膜的稳定性和代表性。为了评估生物膜的组成和特性，研究人员使用了高通量测序和宏基因组分析技术，包括Illumina短读和Oxford Nanopore长读测序，以研究微生物群落的组成变化、从体内到体外的生物膜多样性变化、单核苷酸多态性（SNP）分析以及完整的宏基因组组装基因组（MAGs）。

通过这些技术，研究人员发现这些生物膜中存在大量不同的抗生素耐药基因、毒力因子和生物膜相关因子。这些基因和因子的存在使得多物种生物膜比单一种群生物膜表现出更高的抗生素耐受性。在体外条件下，多物种生物膜的抗生素耐受性显著高于单一种群，尤其是在流动条件下，所有物种的耐受性都进一步增强。

### 抗生素耐药性的评估

为了进一步评估抗生素对多物种生物膜的影响，研究人员使用了标准的抗生素敏感性测试方法，包括盘扩散测试和最小抑菌浓度（MIC）测试。测试了多种抗生素，包括氨基糖苷类（如阿米卡星、庆大霉素、链霉素等）、头孢菌素类、氟喹诺酮类、大环内酯类、磺胺类等。结果显示，所有细菌在流动条件下都表现出更高的抗生素耐受性，而在静态条件下，只有部分细菌显示出类似的耐受性。

此外，研究人员还发现，某些细菌在多物种生物膜中表现出更强的抗生素耐受性，即使它们在单种培养条件下表现出较高的敏感性。例如，在流动条件下，某些细菌的生物膜能够抵抗更高浓度的抗生素，而在静态条件下则容易被清除。这种差异可能与流动条件下的剪切力、营养梯度以及局部微环境的变化有关。

### 抗生素耐药性的机制与影响

通过宏基因组分析和SNP分析，研究人员发现这些多物种生物膜中存在多种抗生素耐药基因。这些基因不仅包括抗生素外排系统，还包括与抗生素耐药性相关的酶、孔蛋白和肽。这些基因的存在使得多物种生物膜在面对抗生素时具有更强的生存能力。

值得注意的是，某些细菌在多物种生物膜中表现出独特的抗生素耐药性，这可能与其在生物膜中的位置、与其他细菌的相互作用以及环境因素有关。例如，某些细菌可能通过与其他细菌的相互作用获得抗生素耐药性，或者通过改变其代谢途径来适应高浓度的抗生素环境。

### 多物种生物膜的动态变化

在研究过程中，研究人员发现多物种生物膜在培养过程中会发生动态变化。某些细菌的丰度在早期培养中显著降低，而在后续的培养中又重新恢复。这种动态变化可能与细菌之间的竞争关系、资源分配以及环境因素有关。

此外，某些细菌在流动条件下表现出更高的丰度，而静态条件下则难以维持。这表明流动条件对于多物种生物膜的形成和维持至关重要。流动条件下的剪切力和营养梯度可能促进了某些细菌的生长和繁殖，而抑制了其他细菌的生长。

### 多物种生物膜的应用前景

本研究建立的多物种生物膜模型不仅有助于理解生物膜的形成和耐药机制，还为开发新的抗菌策略提供了实验平台。这些模型可以用于测试新型抗菌化合物、生物膜破坏剂以及替代治疗策略的有效性。此外，这些模型还可以帮助研究人员进一步探索微生物之间的相互作用、生物膜形成的基本原理以及基因表达的临床相关性。

### 研究的意义与未来方向

本研究的结果表明，多物种生物膜在抗生素耐药性和生物膜形成方面具有独特的特性。这些特性使得传统的单种模型无法准确反映体内感染的实际情况。因此，建立更复杂的多物种模型对于研究和治疗尿道相关感染至关重要。

未来的研究可以进一步探索多物种生物膜中的具体相互作用机制，包括水平基因转移、代谢途径的改变以及生物膜结构的动态变化。此外，还可以研究不同抗生素对多物种生物膜的影响，以及如何通过改变培养条件来优化生物膜模型的稳定性。

### 结论

本研究通过建立基于临床样本的多物种生物膜模型，揭示了多物种生物膜在抗生素耐药性和生物膜形成方面的复杂性。这些模型不仅有助于理解生物膜的动态变化，还为开发有效的抗菌策略提供了实验平台。未来的研究需要进一步探索多物种生物膜中的具体相互作用机制，以更好地应对尿道相关感染的挑战。