基因组挖掘和代谢物分析揭示了Bacillus velezensis TCS001的生物控制作用及促进植物生长的能力

中国农业大学生物系统工程系姜洪珍、刘陆瑶、杨若迪、陈杰、金静等通过基因组测序和代谢组学分析，揭示了海洋来源枯草芽孢杆菌TCS001菌株的基因组特征（4,124,134 bp，含4243个蛋白编码基因）及其代谢产物的多样性（正离子模式检测到2277种代谢物，负离子模式1462种）。研究发现该菌株携带13个次级代谢产物基因簇，包括 surfactin、fengycin和macrolactin家族，并通过UHPLC-MS/MS鉴定出三种新型脂肽类化合物（iturin A2、A3、A4）。其中iturin A4对灰霉病的抑制率最高（77.48%），其作用机制涉及下调真菌磷脂酰丝氨酸脱羧酶基因Bcpsd的表达，破坏膜磷脂平衡。转录组分析显示，TCS001代谢产物通过调控ABC转运蛋白、抗氧化通路及次级代谢合成相关基因表达影响病原菌代谢。该研究为生物农药开发提供了新资源，其代谢组学数据超过现有B. velezensis菌株的2.3倍。

　　

香港中文大学、浙江大学等科研团队针对从渤海海域分离得到的枯草芽孢杆菌TCS001菌株开展了系统性研究，揭示了其作为高效生物农药的分子基础与作用机制。该菌株基因组解析显示其具有独特的遗传特征，代谢组学研究发现其能产生超过3000种次级代谢产物，其中一类名为iturin的脂肽类物质展现出显著抗灰霉病活性，为开发新型生物农药提供了理论依据。### 一、基因组特征与进化分析

TCS001菌株的基因组测序揭示其具有4,124,134 bp的环状染色体，GC含量46.18%，编码4243个蛋白质基因。值得注意的是，该菌株与模式菌株FZB42的基因组高度同源（相似度达89.92%），但在非核糖体肽合成酶（NRPS）基因簇中存在显著差异。通过比较基因组学发现，TCS001基因组中包含2410个单核苷酸多态性（SNP），其中14个NRPS基因簇存在特定SNP富集，暗示其可能产生结构独特的次级代谢产物。这种遗传多样性在Bacillus属中较为罕见，可能与海洋生境的长期进化压力相关。### 二、次级代谢产物体系解析

通过基因组挖掘和代谢组学分析，确认该菌株拥有13个次级代谢产物合成基因簇（BGCs），包括：

1. ** surfactin合成簇**（簇1）：编码表面活性素合成相关酶系

2. ** fengycin合成簇**（簇8）：已知强效抗真菌脂肽

3. ** macrolactin合成簇**（簇6）：含7-O-琥珀酰化修饰的环状内酯类

4. ** bacillaene合成簇**（簇7）：具有膜破坏活性的多肽类

5. ** difficidin合成簇**（簇11）：新型抗生素生物合成单元特别值得注意的是簇4（但irosin家族）和簇13（bacilysin家族）的相似度仅为0.07-0.86，表明其代谢通路具有独特进化特征。代谢组学数据显示，该菌株发酵液（CFS）和粗提物（CLE）中分别检测到2277和1462种代谢物，其中负离子模式下占比达64.3%。通过多级色谱分离纯化，成功鉴定出三种新型iturin类脂肽（A2、A3、A4），其分子量均超过1000 Da，结构特征表现为：

- A2：含13碳线性β-氨基酸链

- A3：含14碳异丁基分支链

- A4：含14碳 anteiso-丁基分支链其中A4的抑制率最高（77.48%），其分子结构中14碳 anteiso-丁酸链的引入增强了膜通透性。### 三、多维度抗真菌机制

#### （一）直接抑菌作用

1. **膜损伤机制**：通过下调Bcpsd基因表达（降幅达5.06 log2 FC值），抑制真菌磷脂酰丝氨酸（PS）向磷脂酰乙醇胺（PE）的转化，导致膜脂质组成失衡（PS/PE比例下降至0.3±0.1）

2. **竞争性抑制**：分泌的macrolactin（A4）与真菌膜蛋白形成不可逆复合物，结合实验显示其与膜磷脂结合亲和力较A2、A3高2.3倍

3. **次级代谢产物协同**：代谢组学检测到共生产生的fengycin（簇8）和bacillaene（簇7），其与iturin形成立体阻隔效应，抑制真菌细胞壁合成#### （二）转录调控网络

RNA-seq分析显示，受A4处理影响的Botrytis cinerea共检测到1296个差异基因（DEGs），其中：

- **膜相关基因**：富集在GO:0016021（膜蛋白整合）和GO:0031224（膜内组分），共84个DEGs（FC>1.5）

- **应激响应基因**：KEGG通路分析显示次级代谢物解毒（bfu00430）和氧化应激（GO:0006979）相关基因上调2.8-4.1倍

- **ABC转运基因**：涉及膜电位调控的基因（bfu02010）下调达3.6倍，暗示膜转运系统被抑制#### （三）代谢物-基因互作网络

通过KEGG富集分析发现，受调控最显著的代谢通路包括：

1. **聚酮合成（bfu00100）**：调控基因丰度达7.2倍

2. **苯丙氨酸代谢（bfu00350）**：关键酶基因（如cinnamoyl-CoA reductase）表达下调达4.8倍

3. **铁载体合成（bfu00430）**：与植物促生代谢网络存在显著重叠### 四、植物促生机制解析

基因组中检测到8个IAA合成相关基因（trpA、trpB、trpC等），其中：

- **nifU**和**nifF**基因簇完整保留，具备固氮能力

- **phoR**（磷酸调节蛋白）和**cheA**（化学感受丝激酶）基因表达上调2.1-3.5倍

- **flhABCD**（ flagellum biosynthesis）基因簇完整，暗示可能通过趋化性信号传导参与植物根际定殖代谢组学证实：

1. **植物激素**：IAA、Gibberellin A89/A125等含量分别达32.7、15.4 μM

2. **抗氧化物质**：mycophenolic acid（抑制ROS生成活性提高2.8倍）、esculetin（清除DPPH自由基效率达92.3%）

3. **磷溶酶系统**：检测到3种α-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.86）和2种α-阿拉伯糖苷酶（EC 3.2.1.79），磷溶能力提升至1.2 mg P/L### 五、应用潜力与挑战

#### （一）生物农药开发优势

1. **广谱活性**：对B. cinerea、P. cinnamon等12种植物病原菌均有效

2. **环境友好**：代谢产物半衰期<72h，pH适应范围4-9

3. **多功能协同**：抗真菌（Iturin家族）+促生长（IAA）+环境修复（磷溶酶）三效合一#### （二）产业化挑战

1. **代谢调控复杂**：需优化碳源（现用淀粉基培养基转化率仅58.3%）

2. **产物分离难题**：CLE中同系物比例（A2:A3:A4=1:2:3）导致纯化成本高

3. **作用机制待完善**：膜损伤与代谢干扰的协同作用机制尚未完全阐明#### （三）改进方向

1. **代谢工程改造**：通过敲除竞争性途径（如 acetate pathway）提升关键代谢物产量

2. **新型提取工艺**：采用超声波辅助提取（频率28kHz，功率500W）可使产率提升40%

3. **制剂稳定性研究**：发现常温下脂肽类物质易水解（半衰期12h），需开发纳米脂质体封装技术### 六、学科交叉创新点

本研究首次构建了"基因组-代谢组-转录组"三维分析模型：

1. **基因组层面**：发现2410个SNP富集在NRPS基因簇，为结构多样性提供基础

2. **代谢组层面**：鉴定出3类新型脂肽（iturin A4等）和5种未报道植物激素

3. **转录组层面**：建立跨物种调控网络（B. cinerea vs. TCS001），发现23个保守调控因子该模型成功解释了TCS001较其他Bacillus属菌株（如B115）具有更强的生物控制效力，其核心差异在于：

- 多环内酯类合成基因簇数量（13 vs. 8）

- IAA前体（色氨酸）转化率（72.3% vs. 58.9%）

- 磷溶酶活性（1.2 mg P/L vs. 0.7 mg P/L）### 七、生态安全评估

1. **土壤微生物群落**：在草莓田试验中，TCS001可显著提升根际细菌多样性（Shannon指数提高0.38）

2. **非靶标植物影响**：检测到Gibberellin A125对大豆苗高促进率达28.6%

3. **环境残留风险**：代谢组学证实其产物半衰期均<24h，符合绿色农药标准### 八、研究展望

1. **代谢物组学深化**：计划建立包含500+种次级代谢物的质谱数据库

2. **合成生物学应用**：拟构建人工合成路径，将 surfactin产量提升至现行水平的3倍

3. **智能制剂开发**：基于代谢组学特征设计响应式缓释剂型，实现田间剂量降低40%本研究为微生物组精准调控提供了新范式，其揭示的"代谢多样性-功能特异性"关联机制，对发展新型生物农药具有重要指导意义。后续研究将聚焦于：

- 代谢通路动态模拟（基于 Petri net建模）

- 环境因子（pH、温度）对产物构型影响

- 植物-微生物互作机制解析