钙通道阻滞剂可以保护Cx26-cKO小鼠免受感觉上皮损伤和听力损失的影响

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Calcium blockers protect against sensory epithelial damage and hearing loss in Cx26-cKO mice

GJB2基因突变导致非综合征性感音神经性耳聋，Cx26缺失引发耳蜗毛细胞退化及内耳微环境紊乱。本研究构建Cx26条件性敲除小鼠模型，证实钙通道阻滞剂（维拉帕米、尼莫地平）可显著降低耳蜗毛细胞损伤并改善听力阈值。该发现为遗传性耳聋的药物治疗提供了新策略。

　　基因突变是导致遗传性听力损失的重要原因之一，其中GJB2基因突变在非综合征性感音神经性听力损失（NSHL）中尤为常见。这一基因编码了连接蛋白26（Cx26），它属于连接蛋白家族，能够通过形成缝隙连接通道，促进细胞间的离子、ATP、葡萄糖等代谢物质的双向运输。Cx26在耳蜗的支持细胞中起着关键作用，不仅参与听觉信号的传导，还在耳蜗的后天成熟过程中发挥重要作用。在某些GJB2相关听力损失患者中，耳蜗的感音上皮细胞死亡和柯蒂氏器的发育异常是主要的病理特征。然而，尽管已有大量研究，Cx26缺乏如何导致毛细胞死亡的分子机制仍不完全清楚，这在一定程度上是因为不同实验模型之间的差异。

钙离子稳态对于维持多种生理功能至关重要，尤其是在听觉系统中。机械-电转换、听神经信号的产生以及耳蜗内环境的维持都依赖于细胞内的钙离子。研究表明，较低的线粒体钙含量（<40 nmol/mg）对于能量生成是必要的，而在钙过载状态下（>40 nmol/mg），线粒体ATP合成受到抑制，从而破坏细胞能量稳态。持续的钙过载还会导致线粒体基质酶活性变化和线粒体膜超微结构改变，引发线粒体肿胀和碎片化，这会刺激氧化磷酸化，迅速增加线粒体活性氧的积累。同时，钙依赖性蛋白酶和磷脂酶被激活，协调启动多模式的细胞死亡程序。钙过载可以直接激活钙依赖性蛋白酶，如钙蛋白酶（calpain），当细胞内钙浓度异常升高时，会直接激活这些酶。此外，持续的钙浓度升高可能间接影响某些钙依赖性蛋白酶的表达水平。虽然钙过载可以激活钙调素（calcineurin），但目前尚无直接证据表明它会增加钙蛋白酶的转录水平。

值得注意的是，小鼠的听觉系统在出生后经历显著的成熟过程，大约在出生后第14天（P14）开始具备功能性听觉感知能力。在这个关键时期，外部声音刺激会驱动耳蜗微环境的重塑，表现为ATP生成增加和钾离子回收增强。研究发现，耳蜗支持细胞通过缝隙连接转移和释放ATP，而Tritsch等人进一步指出，支持细胞会周期性地释放ATP，并作为P2X嘌呤受体，使相邻毛细胞产生肌醇1,4,5-三磷酸（IP3），从而促进内质网中钙离子的释放。Cx26的基因缺失会破坏这种代谢同步性，影响听觉发育期间的离子再分布和能量底物的输送。有趣的是，Cx26-cKO小鼠中毛细胞退化的时间与听觉成熟时间一致，这提示Cx26的缺失可能使耳蜗微环境在发育过程中变得脆弱，进而导致毛细胞死亡。因此，我们推测Cx26的缺失可能导致耳蜗微环境的紊乱或无法适应正常的生理变化，从而引发毛细胞退化。

在本研究中，我们首先构建了特定的Cx26敲除小鼠模型，并评估了听力损失和毛细胞损伤的模式。进一步地，我们利用免疫荧光染色和Western blot技术分析了耳蜗中钙依赖性蛋白的表达水平。结果显示，Cx26-cKO小鼠的毛细胞中calpain2和calcineurin的表达显著增加。为了探讨钙通道阻断剂是否能够有效减少Cx26敲除导致的毛细胞损伤和听力损失，我们选择了两种钙通道阻断剂——维拉帕米（verapamil）和尼莫地平（nimodipine），并评估了它们对Cx26-cKO小鼠听力和毛细胞损失的影响。结果显示，无论是维拉帕米还是尼莫地平，都显著保护了毛细胞免受退化，并改善了听力损失。这些发现不仅建立了Cx26缺乏、钙失调与毛细胞退化之间的因果关系，还识别了药物调节钙信号作为治疗策略的可行性。因此，我们得出结论，钙通道阻断剂可能成为保护Cx26-cKO小鼠毛细胞的重要手段，这种保护作用也可能扩展到其他内耳疾病。

为了评估钙通道阻断剂对Cx26-cKO小鼠听力和毛细胞损伤的影响，我们构建了Cx26-floxed；Fgfr3-iCreERT2小鼠模型，并在出生后第0天和第1天通过皮下注射他莫昔芬（tamoxifen）诱导Cre重组酶活性，从而实现Cx26在Fgfr3阳性细胞中的条件性敲除，这些细胞主要包括支柱细胞（PCs）和戴特尔细胞（DCs）。实验中，我们观察到Cx26-cKO小鼠在基底转中出现显著的外毛细胞（OHCs）丢失，而内毛细胞（IHCs）则未见明显损失。在对这些小鼠进行钙离子水平检测时，我们发现它们的毛细胞中钙离子浓度显著升高。这表明，Cx26的缺失可能导致耳蜗微环境中钙离子的异常积累，进而引发毛细胞损伤。

为了进一步验证钙通道阻断剂的效果，我们选择了两种药物——维拉帕米和尼莫地平，对Cx26-cKO小鼠进行连续七天的腹腔注射，并在出生后第18天和第48天评估它们的听力功能和毛细胞存活情况。结果显示，无论是维拉帕米还是尼莫地平，都能显著降低Cx26敲除导致的听力损失，并提高毛细胞的存活率。在长期治疗的情况下，这些药物同样显示出保护作用，表明钙通道阻断剂可能在一定程度上延缓或阻止由Cx26缺失引起的听力损失。此外，定量分析还显示，尼莫地平的保护效果优于维拉帕米，这可能与其脂溶性有关，使其更容易穿过血-迷路屏障，达到更高的内耳药物浓度。

在讨论部分，我们回顾了GJB2基因突变的临床表现，从严重的先天性感音神经性耳聋到延迟性进展性听力损失。通过构建多种Cx26条件性敲除小鼠模型，研究人员已经对Cx26缺乏导致的耳蜗毛细胞损伤的病理机制进行了广泛研究。例如，依赖于caspase-3的凋亡被认为是内耳毛细胞损伤的主要形式之一，特别是在噪声性耳聋模型中。此外，氧化应激也被认为是Cx26-cKO小鼠模型中耳蜗毛细胞损伤的一个重要因素。Cx26的缺失会阻碍相邻细胞之间活性氧（ROS）的传递，导致毛细胞中ROS的过度积累，从而引发细胞损伤。过量的细胞内氧化应激还会导致不可逆的DNA损伤。Parthanatos是一种依赖于聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP-1）但不依赖于caspase的程序性细胞死亡形式，其由DNA损伤引发并由PARP-1的过度激活介导。虽然PARP-1是DNA损伤修复的重要介质，但其过度激活会导致聚ADP-核糖（PAR）的过度积累，使凋亡诱导因子转移到细胞核，从而导致DNA双链断裂和细胞死亡。我们的研究显示，在Cx26-cKO小鼠模型中观察到了DNA损伤和PARP-1的过度激活，提示Parthanatos可能是毛细胞死亡的一种形式。使用PARP-1抑制剂可以显著减轻Cx26敲除引起的听力损伤和毛细胞丢失。

近年来，免疫反应也被认为在多种耳蜗感音上皮细胞损伤的病理过程中起作用。我们的研究确认了Cx26敲除引起的毛细胞和螺旋神经节细胞损伤与巨噬细胞相关的免疫反应有关。此外，我们还发现系统性注射地塞米松可以显著保护Cx26-cKO小鼠模型中的毛细胞，这种保护作用可能与抑制巨噬细胞相关免疫反应有关。基因治疗被认为是单基因遗传病最有前景的治疗方法之一，特别是在针对特定基因突变如耳蜗蛋白（OTOF）的精准治疗方面。AAV-OTOF在患有先天性耳聋的儿童中显示出显著的治疗效果。然而，针对GJB2突变相关的遗传性听力损失的基因治疗尚未取得突破性进展。尽管如此，多个研究团队仍在积极探索治疗方案。例如，Yu等人尝试将病毒载体注入内耳以重建Cx26的表达，并成功在Cx26-cKO小鼠中恢复了耳蜗支持细胞的缝隙连接通道，但这种干预并未显著改善小鼠的听力功能。Wang等人最近的研究则表明，病毒介导的Cx26表达与地塞米松联合使用可以恢复Cx26-cKO小鼠的听力功能。

综上所述，本研究通过构建Cx26-cKO小鼠模型，评估了钙通道阻断剂对听力损失和毛细胞损伤的保护作用。结果显示，维拉帕米和尼莫地平均能显著减少Cx26敲除导致的毛细胞死亡和听力损失。这些发现不仅揭示了Cx26缺乏、钙失调与毛细胞退化之间的因果关系，还为内耳疾病的治疗提供了新的思路。钙通道阻断剂可能成为保护毛细胞免受损伤的重要手段，其保护作用可能不仅限于GJB2相关的听力损失，还可能扩展到其他内耳疾病。此外，本研究还指出了未来研究的方向，即进一步探讨钙通道阻断剂的作用机制，以及探索其他潜在的治疗策略，如基因治疗和免疫调节。