利用从小麦胚无细胞系统中提取的未纯化蛋白质对单珠单化合物环肽文库进行筛选，以鉴定蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂

《Bioorganic & Medicinal Chemistry》：Screening of one-bead one-compound cyclic peptide libraries using unpurified proteins from the wheat germ cell-free system to identify protein-protein interaction inhibitors

本研究开发了一种新型环肽筛选平台，无需纯化目标蛋白即可高效筛选PPI抑制剂。通过整合OBOC库与小麦胚芽细胞-free系统合成的未纯化MDM2蛋白，成功鉴定出具有微摩尔级抑制活性的17个候选化合物，并经对接模拟验证其结合机制。该方法为难以纯化的药物靶点提供了高效筛选策略。

　　本研究探讨了一种新型的筛选平台，用于发现针对蛋白-蛋白相互作用（PPIs）的抑制剂。PPIs在调节多种生理和病理过程方面发挥着关键作用，因此成为药物开发的重要靶点。然而，由于PPIs通常具有较大的、浅显的和缺乏明显特征的结合界面，传统的药物筛选方法往往难以有效识别其抑制剂。为此，研究人员提出了一种创新的策略，结合了One-Bead One-Compound（OBOC）库和通过小麦胚芽细胞自由系统（wheat germ cell-free system）合成的粗提靶蛋白，从而避免了对纯化蛋白的依赖。

在传统的PPI抑制剂筛选过程中，通常需要对靶蛋白进行纯化以确保筛选的准确性。然而，纯化过程可能会导致蛋白生物活性的损失，同时增加了实验的复杂性和成本。此外，不同靶蛋白的纯化方法可能各不相同，使得整个筛选流程缺乏标准化。为了克服这些限制，一些研究团队尝试使用细胞裂解物进行大规模筛选，但这种方法不仅耗时耗力，而且某些蛋白在细胞系统中难以表达。因此，寻找一种能够有效利用未纯化蛋白的筛选平台，成为PPI靶向药物开发中的一个重要课题。

小麦胚芽细胞自由系统作为一种高效的蛋白合成工具，在基因组时代展现出巨大的应用潜力。该系统能够以较低的成本和较高的效率合成全长的生物活性蛋白，适用于多种真核生物。此外，它还能够合成一些在传统细胞表达系统中难以获得的蛋白质，如某些人类蛋白或复杂的多结构域蛋白。基于这些优势，研究人员设想是否可以将未纯化的蛋白质作为“诱饵”（bait）蛋白，用于OBOC库的筛选。如果可行，这将极大简化筛选流程，提高筛选效率，并拓宽PPI药物开发的应用范围。

在本研究中，研究人员选择了p53-MDM2相互作用作为模型靶点。p53和MDM2之间的相互作用在癌症治疗中具有重要意义，因为MDM2能够抑制p53的活性，而p53是细胞凋亡和DNA修复的关键调控因子。通过将OBOC随机环肽库与通过小麦胚芽系统合成的未纯化MDM2蛋白进行结合筛选，研究人员成功识别出17个候选结合物。进一步的实验表明，这些候选结合物能够有效抑制p53-MDM2相互作用，并在微摩尔范围内表现出显著的活性。此外，通过分子对接模拟，研究人员还确认了这些环肽与MDM2结合的关键氨基酸残基，从而验证了其抑制作用的机制。

这一方法的成功不仅证明了小麦胚芽系统合成的未纯化蛋白在PPI药物筛选中的可行性，也为未来的药物发现提供了新的思路。传统上，PPI药物开发依赖于高通量筛选技术，如噬菌体展示、mRNA展示和DNA编码库（DEL）等。这些方法虽然在某些情况下有效，但通常需要对靶蛋白进行严格的纯化，以减少非特异性结合的干扰。相比之下，OBOC库的筛选方法能够在单个珠子上进行组合筛选，结合化学合成的优势，使得筛选过程更加灵活和高效。然而，OBOC库的多样性通常低于其他技术，这限制了其在某些复杂靶点中的应用。

研究人员提出的新方法利用了小麦胚芽系统合成的未纯化蛋白作为诱饵蛋白，结合OBOC库进行筛选。这种方法的优势在于，它不需要对靶蛋白进行纯化，从而避免了可能的生物活性损失。同时，由于OBOC库的构建和筛选过程完全基于化学合成，因此可以自由地引入非天然氨基酸，提高环肽的结构多样性和结合能力。此外，这种方法还简化了实验流程，降低了操作难度和成本，使得大规模筛选成为可能。

为了验证该方法的有效性，研究人员首先构建了带有不同标签的重组蛋白，包括 FLAG-GST 标签的 MDM2 作为靶蛋白，以及生物素标记的 p53 和二氢叶酸还原酶（DHFR）作为阴性对照。随后，他们使用 AlphaScreen 技术评估了这些环肽对 p53-MDM2 相互作用的抑制效果。结果显示，未纯化蛋白的使用并未影响筛选的准确性，反而提高了实验的可行性和效率。这一发现表明，通过小麦胚芽系统合成的未纯化蛋白可以作为有效的筛选材料，用于识别针对PPIs的环肽抑制剂。

在筛选过程中，研究人员采用了荧光激活珠子分选（fluorescence-activated bead sorting）和基于质谱的数据库搜索相结合的方法，以提高筛选的特异性和准确性。这种方法不仅能够快速筛选出潜在的结合物，还能够通过序列分析确定其化学结构，从而为后续的结构优化和药物开发提供依据。此外，分子对接模拟的应用进一步揭示了这些环肽与MDM2结合的详细机制，为理解其作用方式提供了重要的理论支持。

这项研究的意义在于，它为PPI靶向药物的开发提供了一种新的策略。通过结合OBOC库和小麦胚芽系统，研究人员成功地实现了对未纯化蛋白的高效筛选，这不仅降低了实验成本，还提高了筛选的灵活性和适用性。这种方法特别适用于那些难以纯化的靶蛋白，例如某些膜结合蛋白或具有复杂结构的蛋白。此外，它也为其他类型的PPI靶点提供了可行的筛选方案，为未来的药物发现开辟了新的途径。

随着对PPIs研究的深入，越来越多的药物靶点被发现，而传统的药物筛选方法在面对这些复杂靶点时显得力不从心。因此，开发新的筛选技术，如本研究中提出的OBOC库与小麦胚芽系统结合的方法，显得尤为重要。该方法不仅能够克服传统筛选方法的局限性，还能够提高药物开发的效率，使得更多潜在的PPI抑制剂得以发现和优化。

总之，这项研究通过结合OBOC库和小麦胚芽系统，成功地实现了对未纯化蛋白的高效筛选。这一方法的应用为PPI靶向药物的开发提供了新的可能性，使得更多难以纯化的蛋白成为可被研究的药物靶点。未来，随着技术的不断进步，这种方法有望在药物发现领域发挥更大的作用，为治疗多种疾病提供新的药物候选。