新型2-苯基亚氨基-4,5-二苯基呋喃-3-碳腈衍生物及其苯基氨基类似物：合成、体外细胞毒性、蛋白激酶抑制活性及计算机模拟研究

《Bioorganic Chemistry》：New 2-benzylideneamino-4,5-diphenylfuran-3?carbonitrile derivatives and their benzylamino analogues: Synthesis, in vitro cytotoxicity, protein kinase inhibitory activity and in silico insights

本研究合成了4,5-二苯基-2-取代呋喃-3-碳氰基Schiff碱及其苯基胺衍生物，评估了细胞毒性。化合物7c对21种癌细胞线（50.17%-174.62%）抑制显著，并抑制EGFR和CDK2。Western blot显示降低EGFR、pEGFR、CDK2及pCDK2蛋白表达，诱导细胞凋亡，并证实其安全性及口服吸收潜力。

　　本研究围绕一类新型化合物的设计、合成与生物活性评估展开，旨在开发具有更强抗癌效果的药物。这些化合物以4,5-二苯基呋喃-3-碳氰基为基本结构，通过引入苯乙醛胺或苯乙胺侧链，形成一系列席夫碱（Schiff bases）及其衍生化合物。这些化合物被命名为3a-c、6a-d以及它们的苯乙胺衍生物4a-c和7a-d。研究的主要目标是探索这些化合物对多种肿瘤细胞的抑制效果，特别是对EGFR（表皮生长因子受体）和CDK2（细胞周期依赖性激酶2）这两种在癌症发展中起关键作用的蛋白激酶的抑制能力。

癌症仍是全球范围内的主要死亡原因之一，尽管已有多种治疗策略，但大多数方法在治疗过程中会对正常细胞造成一定程度的损伤。因此，开发更具针对性的治疗方案，以减少对健康组织的副作用，成为当前癌症研究的重要方向。蛋白激酶，尤其是EGFR和CDK2，因其在细胞异常增殖、肿瘤发生、发展和转移中的重要作用，成为药物研发的热点靶点。EGFR是一种跨膜受体酪氨酸激酶，当其与特定配体如表皮生长因子（EGF）或转化生长因子-α（TGF-α）结合时会被激活，从而调控细胞的生长、分化和存活。EGFR在多种恶性肿瘤中被过度表达，包括乳腺癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌和胰腺癌，因此，针对EGFR的抑制剂在抗癌治疗中具有重要意义。

CDK2是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要在细胞周期从G1期向S期的过渡中起关键作用。CDK2的异常激活，通常由其调控因子（如cyclin A和cyclin E）的过表达或扩增引起，已被发现与多种人类癌症有关，如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、结直肠癌和胰腺癌。因此，CDK2抑制剂在阻止癌细胞增殖方面展现出良好的潜力。

已有研究表明，一些含有苯乙醛胺或苯乙胺基团的杂环化合物具有显著的抗癌活性和蛋白激酶抑制能力。例如，某些2-吡啶-3-基喹唑啉衍生物表现出对EGFR的强力抑制作用，其IC50值与吉非替尼（Gefitinib）相近，同时对A549肺癌和MCF-7乳腺癌细胞也显示出一定的细胞毒性。苯乙醛胺肼基喹唑啉衍生物则显示出比阿法替尼（Afatinib）更强的EGFR抑制能力，并对HCT-116结肠癌细胞表现出显著的细胞毒性。此外，一些含有苯乙胺基团的化合物也显示出对多种癌细胞的高效抑制作用，其中某些化合物的IC50值甚至优于现有的抗癌药物，如多柔比星（Doxorubicin）和吉非替尼。

基于这些已有成果，本研究设计并合成了4,5-二苯基-2-取代呋喃-3-碳氰基席夫碱及其苯乙胺衍生物，旨在开发具有更强抗癌活性的新化合物。研究团队首先合成了4,5-二苯基呋喃-3-碳氰基的中间体，然后与不同取代的苯乙醛胺反应，生成席夫碱化合物3a-c和6a-d。随后，这些席夫碱进一步与苯乙胺反应，得到其苯乙胺衍生物4a-c和7a-d。通过这种方法，研究团队成功构建了一系列具有潜在抗癌活性的化合物。

为了评估这些化合物的抗癌效果，研究团队将其在NCI-60人类肿瘤细胞系中进行了细胞毒性测试。结果显示，苯乙胺衍生物4a-c和7a-d相较于它们的席夫碱前体表现出更强的细胞毒性，其中7c在多个细胞系中显示出显著的细胞生长抑制效果。具体而言，7c在21种细胞系中表现出的GI%（生长抑制百分比）范围为50.17%至174.62%，这表明该化合物具有广泛的抗癌潜力。进一步的五剂量实验显示，7c在对白血病（Hela-60）、结肠癌（HCT-116）和黑色素瘤（LOX-IMVI）细胞的抑制作用方面表现尤为突出。

为了确保化合物的安全性，研究团队还评估了其对正常细胞的毒性。结果显示，7c对HCT-116、LOX-IVMI以及两种正常细胞系WI-38和Vero细胞均表现出较低的细胞毒性，这表明该化合物可能具有较好的选择性，能够有效抑制癌细胞而对正常细胞影响较小。此外，7c对野生型EGFR和CDK2的抑制能力显著，这进一步支持了其作为抗癌药物的潜力。

在对HCC827细胞（一种对酪氨酸激酶抑制剂高度敏感的细胞模型）的测试中，研究团队发现7c的抑制效果不如厄洛替尼（Erlotinib），这表明该化合物可能对某些特定的EGFR突变型细胞效果有限，但仍对野生型EGFR具有一定的抑制作用。通过Western blot分析，研究团队进一步验证了7c对EGFR、磷酸化EGFR（pEGFR）、CDK2和磷酸化CDK2（pCDK2）蛋白表达水平的降低作用，这为7c的抗癌机制提供了分子层面的证据。

研究还发现，7c能够诱导HCT-116和LOX-IMVI细胞的细胞周期阻滞，分别在G1期和S期表现出显著的抑制效果。这种细胞周期阻滞是抗癌药物常见的作用机制之一，能够有效阻止癌细胞的增殖。此外，7c还能促进细胞凋亡，其作用机制可能涉及对凋亡相关蛋白的调控。例如，在HCT-116细胞中，7c显著增加了Bax蛋白的表达水平，同时降低了Bcl-2蛋白的表达，这表明该化合物可能通过调控Bax和Bcl-2的比值，促进细胞凋亡的发生。同时，7c还能显著增加caspase 3和caspase 9的活性，这两种蛋白酶在细胞凋亡过程中起着至关重要的作用，进一步支持了7c的促凋亡效果。

除了细胞毒性测试，研究团队还对7c的药代动力学和药物代谢特性进行了评估。通过计算机模拟（in silico）研究，团队发现7c与EGFR和CDK2活性位点之间的结合模式与其强效的抑制活性相吻合。此外，ADME（吸收、分布、代谢和排泄）预测结果显示，7c具有良好的口服吸收能力，这为其作为口服抗癌药物提供了理论基础。

研究团队还对7c的化学合成过程进行了详细描述。他们首先合成了4,5-二苯基呋喃-3-碳氰基的中间体，并通过与不同取代的苯乙醛胺反应，生成席夫碱化合物3a-c和6a-d。随后，这些席夫碱进一步与苯乙胺反应，得到其苯乙胺衍生物4a-c和7a-d。合成过程中采用了多种标准方法，包括在乙醇中进行反应，并加入少量冰乙酸以促进反应的进行。这些化合物的合成步骤经过了详细的文献调研和实验验证，确保了其结构的正确性和合成的可行性。

为了进一步确认这些化合物的化学结构和纯度，研究团队对其进行了熔点测定、元素分析和红外光谱分析。熔点测定采用开放式毛细管管法，使用Stuart SMP10熔点测定仪进行，结果未经过校正。元素分析则在埃及亚历山大大学的区域真菌学与生物技术中心进行，而红外光谱分析则使用了日本Shimadzu公司的FT-IR 8400S光谱仪，结果以波数（cm?1）表示。这些分析方法的使用确保了化合物的结构准确性和纯度，为后续的生物活性测试提供了可靠的化学基础。

研究团队还对7c的细胞周期阻滞和促凋亡效果进行了深入探讨。在HCT-116细胞中，7c主要在G1期诱导细胞周期阻滞，而在LOX-IMVI细胞中则主要在S期发挥作用。这种细胞周期阻滞可能是由于7c对CDK2的抑制作用，因为CDK2在细胞周期从G1期向S期的过渡中起着关键作用。此外，7c还能促进细胞凋亡，其促凋亡效果可能与对Bax和Bcl-2蛋白的调控有关。Bax是一种促凋亡蛋白，而Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，两者之间的平衡对于细胞凋亡的调控至关重要。通过增加Bax的表达和减少Bcl-2的表达，7c可能促进了细胞凋亡的发生。

在促凋亡机制方面，研究团队还发现7c能够显著增加caspase 3和caspase 9的活性。这两种蛋白酶在细胞凋亡的执行阶段起着关键作用，它们的激活通常意味着细胞凋亡的启动。因此，7c可能通过激活这些蛋白酶，进而诱导细胞凋亡的发生。这种促凋亡作用可能是其抗癌效果的重要机制之一。

除了对细胞周期和凋亡的影响，研究团队还评估了7c对蛋白激酶的抑制能力。结果显示，7c对野生型EGFR和CDK2具有较强的抑制作用，而对突变型EGFR（如EGFR T790M）的抑制效果则相对较弱。这可能意味着7c对某些特定的EGFR突变型细胞效果有限，但对野生型EGFR仍具有一定的抑制作用。这一发现对于未来开发针对特定EGFR突变型的抗癌药物具有一定的参考价值。

研究团队还通过Western blot技术进一步验证了7c对EGFR和CDK2蛋白表达水平的影响。Western blot分析显示，7c能够显著降低EGFR和CDK2的表达，这可能是其抑制这些蛋白激酶活性的直接证据。此外，研究还发现，7c对磷酸化EGFR和磷酸化CDK2的抑制效果更为显著，这表明该化合物可能不仅抑制了这些蛋白的表达，还影响了它们的活性状态。

为了更全面地了解7c的分子作用机制，研究团队还进行了计算机模拟分析。通过模拟，他们发现7c与EGFR和CDK2活性位点之间的结合模式与实验结果相符，这表明其抑制活性可能与其与这些蛋白的相互作用密切相关。此外，ADME预测结果表明，7c具有良好的口服吸收能力，这为其作为口服药物的应用提供了理论支持。

综上所述，本研究通过设计和合成一系列含有苯乙胺基团的4,5-二苯基呋喃-3-碳氰基衍生物，探索了其在抗癌治疗中的潜力。实验结果显示，这些化合物，尤其是7c，表现出显著的细胞毒性，并对多种癌细胞具有良好的抑制效果。此外，7c对EGFR和CDK2的抑制作用以及其诱导细胞凋亡的能力，进一步支持了其作为抗癌药物的潜力。研究团队还对这些化合物的化学合成、结构分析以及药代动力学特性进行了详细探讨，为未来开发新型抗癌药物提供了重要的理论依据和实验数据。